[发明专利]焦磷酸测序法检测ABCC10基因试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测ABCC10基因多态性的试剂 盒及方法。

背景技术

替诺福韦是一种核苷酸类逆转录酶抑制剂，临床应用于治疗艾滋病、乙肝等的抗病 毒药物。替诺福韦酯是替诺福韦的前药，口服药物替诺福韦酯具有水溶性，可被迅速吸 收并降解成活性物质替诺福韦，替诺福韦然后被转变为活性代谢产物替诺福韦双磷酸 盐。活性成分替诺福韦双磷酸盐可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制 病毒聚合酶，及通过插入DNA中终止DNA链。该药通过干扰病毒DNA聚合酶的功能， 抑制病毒复制，降低血清及组织内的病毒载量从而具有潜在的抗病毒的活性。替诺福韦 几乎不经胃肠道吸收，通过肾小球过滤和主动小管转运系统排泄，约70％～80％以原形 经尿液排出体外。近端肾小管上皮细胞是替诺福韦酯的主要作用靶点。因为近端小管的 上皮细胞有复杂的药物转运机制，主要包括OAT1和OAT3转入蛋白及MRP-2、 MRP-4和MRP-7转出蛋白等转运蛋白。其编码基因的SNP突变可能影响其蛋白活性从而 导致替诺福韦的蓄积，毒副反应增加，疗效降低。MRP-7的编码基因为ABCC10,其 nearGene-5区存在526G>A(rs9349256)突变，可能影响ABCC10的活性，从而影响MRP-7 对替诺福韦的转出过程。rs9349256与尿无机磷消耗及β2小球蛋白显著相关，P值分别为 0.02与0.04,等位基因A携带者发生慢性肾脏疾病的风险是等位基因G携带者的2.3倍(J InfectDis.2011Jul1；204(1):145-53.)。我们进一步研究发现，携带rs9349256突变纯合子 AA和突变杂合子GA的在治疗48周后的CD4免疫应答分别为携带GG野生型纯合子的 31.2％和40.8％，携带GA+AA型患者CD4免疫应答效应为携带GG型患者的38.6％， P＝0.002。

综上所述，对ABCC10基因nearGene-5区rs9349256单核苷酸多态性进行分析检测可 作为替诺福韦不良反应及疗效预测的有效指标，为临床制定替诺福韦抗病毒治疗方案提 供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测ABCC10基因多态性的试剂盒将为 替诺福韦的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电 泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成 本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

ABCC10基因多态性是替诺福韦不良反应预测的有效指标。本发明提供一种检测影响 ABCC10rs9349256(G>A)单核苷酸多态性的试剂盒，以实现快速、简便、准确、高效、 实用、经济的检测替诺福韦个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

所述焦磷酸测序法检测ABCC10基因多态性试剂盒，包括如下引物：

(1)扩增引物：

ABCC10(rs9349256)上游引物：5′-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3′(SEQID NO.1)；

ABCC10(rs9349256)下游引物：5′-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3′(SEQID NO.2)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：

ABCC10(rs9349256)测序引物：5′-TTCACTCTCTCCTGACC-3′(SEQIDNO.3)；

其中，ABCC10rs9349256(G>A)目标序列：野生型CCTTTGTCCAA(SEQID NO.4)、突变型CCTTTATCCAA(SEQIDNO.5)。

利用上述试剂盒检测ABCC10基因多态性的方法，不包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应