[发明专利]间日疟原虫烯醇化酶的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种间日疟原虫烯醇化酶(enolase)的制备及其应用。

背景技术

疟疾是由疟原虫引起的一种流行广泛，危害严重的虫媒传染病，与艾滋病和结核 病一起被列为世界上最具威胁的三大传染病，在全球100多个国家和地区流行，30多亿人受 疟疾感染危险，每年约有2亿多病例，近60万人死亡。寻找和研发安全有效的疟疾疫苗或治 疗新药物，将成为全球和我国消除疟疾的急迫需求。

烯醇化酶(enolase)最初发现是细胞糖酵解中的关键酶之一，后来发现它能够表 达在疟原虫表面并不依赖于其酶活性通过与宿主蛋白结合介导疟原虫侵入。上世纪60年代 和70年代，我国曾两次发生大范围的疟疾暴发流行，年发病人数最多时超过3000万，给当时 的人民群众，特别是工农业生产造成了严重影响。经过几十年的努力，我国疟疾防治取得了 显著的成绩，疟疾发病率已大幅度下降。但2000年以来，由于全球气候变暖等多种自然和社 会因素的影响，我国中、南部地区出现了疟疾疫情回升和局部暴发流行，特别是间日疟。既 然烯醇化酶(enolase)能够介导疟原虫侵入宿主，发挥重要作用，所以我们建立了一种简便 的能够大量制备间日疟原虫烯醇化酶(enolase)方法及以鼠疟模型发现其能够抑制疟原虫 生长并保护宿主。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种间日疟原虫烯醇化酶的制 备及其应用，能够简便的大量制备间日疟原虫烯醇化酶，并实现抑制疟原虫生长的应用。

按照本发明提供的技术方案，所述一种间日疟原虫烯醇化酶的制备，特征是，包括 以下步骤：

(1)扩增间日疟原虫烯醇化酶(enolase)基因：提取间日疟原虫基因组，采用引物 P2和引物P3扩增第一段enolase基因，然后再以第一段enolase基因为模版，以引物P1和引 物P3扩增出enolase基因；

(2)构建pET28α/enolase表达载体：

a、纯化步骤(1)得到的enolase基因；

b、将pET28α质粒酶切、提纯得到线性化的pET28α质粒载体；

c、将线性化的pET28α质粒载体和enolase基因连接，得到pET28α/enolase表达载 体；

(3)重组enolase蛋白表达和纯化：将pET28α/enolase表达载体转化到BL-21(DH3) pLys感受态细菌上，培养后的细菌进行诱导、纯化。

进一步的，所述引物P1为5’-cggccatatggcccacgtaattactcgtatttctgcccgtgaaat tttgg-3’；所述引物P2为5’-gtatttctgcccgtgaaattttggactcccgaggaaacccaaccg-3’；所述 引物P3为5’-agcagcggccgctcaacttaattggtgcctaaatttctc-3’。

进一步的，所述步骤(1)扩增过程为：94℃、4min；94℃、30sec；50℃、30sec；72℃、 1.5min，共30个循环；72℃、7min；4℃、12min。

进一步的，所述纯化enolase基因具体为：使用PCR产物纯化试剂盒提纯步骤(1)得 到的enolase基因后，以限制性内切酶NdeI和NotI进行酶切提纯，经1％琼脂糖凝胶电泳 后，用AgaoseGelExtractionKit提纯。

所述间日疟原虫烯醇化酶体内抑制疟原虫生长并保护宿主的应用。

本发明所述间日疟原虫烯醇化酶的制备及其应用，能够简便的大量制备间日疟原 虫烯醇化酶，并实现抑制疟原虫生长的应用。

附图说明

图1A为间日疟原虫烯醇化酶(enolase)基因的扩增过程示意图。

图1B为pET28α/enolase表达载体图谱。

图2为间日疟原虫烯醇化酶(enolase)鉴定示意图。

图3为抗间日疟原虫烯醇化酶(enolase)抗体体外抑制恶性疟原虫结果。

图4A、图4B为间日疟原虫烯醇化酶(enolase)体内抑制疟原虫生长结果，图4A为原 虫感染率示意图，图4B为小鼠存活率示意图。

具体实施方式

下面结合具体附图对本发明作进一步说明。