[发明专利]一种融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种融合蛋白及其应用。

背景技术

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科栝楼属植物栝楼(TrlchosanthesKirilowii Maxim)的根块中提取出的一种碱性蛋白，属于I型核糖体失活蛋白。传统中药天花粉在我国 已有上千年的药用历史，历代古医书中对其性状和应用都有详细的记载。天花粉蛋白最初临 床上主要用于引产及宫外孕等，后来陆续发现它具有广泛的药理作用，包括抗病毒，抗肿瘤 作用等，其中天花粉蛋白的抗肿瘤作用尤为引人注目。实验表明，天花粉蛋白对HeLa细胞 的生长具有明显的抑制作用，可以将HeLa细胞阻滞于S期，诱导HeLa细胞发生凋亡(何金 峰,李继承.天花粉蛋白抑制HeLa细胞生长及诱导细胞凋亡之机制探讨.解剖学报.2006,37: 309)。

然而，天然提取的和基因工程表达的未经修饰的天花粉蛋白用于抗肿瘤治疗遇到的一个 突出问题是，并非所有类型的肿瘤都对天花粉蛋白的细胞毒效应敏感。研究显示，宫颈癌来 源的HeLa细胞对天花粉蛋白敏感，而肝癌来源的HepA-H细胞则不敏感。对这些不敏感的 肿瘤，如果单纯采用增加天花粉剂量的方法，则有可能导致临床上无法接受的毒副反应。这 种反应的差异性大大限制了天花粉蛋白作为抗肿瘤药物的使用范围和效能。

一般认为，天花粉蛋白对不同细胞的毒性的差异取决于它能够穿过细胞膜到达细胞内靶 位点的效率，而它的跨膜转运是由膜受体介导的。因此，如何将天花粉蛋白在分子水平加以 改造，使其能够高效进入肿瘤靶细胞，以通过减量增效而降低其毒副反应，扩大其抗肿瘤临 床应用范围，具有至关重要的意义。

在肿瘤生物治疗研究和临床实践中，采用蛋白质转导技术可将治疗蛋白高效转导进入靶 细胞。蛋白质转导技术是将目的蛋白与一段“蛋白转导肽”(或称“细胞穿透肽”)在分子水 平连接，构成融合蛋白。这样的融合蛋白能自动穿过细胞膜进入细胞内，而毋需任何其它辅 助试剂。迄今已发现多种具有蛋白转导活性的蛋白或肽成分，但其中研究得最为深入的是衍 生于艾滋病毒(HIV)的TAT转导肽。

自从蛋白质转导技术发明以来，TAT肽一直是应用最广、研究最深入的细胞转导(穿透) 肽。然而，2007年美国哈弗大学的DavidR.Liu实验室通过研究绿色荧光蛋白(GFP)的分 子表面结构，发现在不影响蛋白荧光特性的前提下，把非保守氨基酸替换成一些带正电荷或 负电荷的氨基酸，得到一些“超电荷蛋白”(LawrenceMS,PhillipsKJ,LiuDR.Supercharging proteinscanimpartunusualresilience.JAmChemSoc.2007；129(33):10110-2)。这样的超电荷蛋 白不仅保持原有的荧光等性能，而且获得了一些不同寻常的新的特性。经过基因工程改造而 使表面带有36个正电荷的超正电荷绿荧光蛋白(+36GFP)由于静电排斥作用，使蛋白溶液 具有更高的稳定性或抗变性特性，而最引人注目的是，+36GFP及其偶联的融合蛋白也具有细 胞转导/穿透效能，而且其细胞转导/穿透效能比经典的TAT肽高100倍(CronicanJJ,etal.Potent deliveryoffunctionalproteinsintoMammaliancellsinvitroandinvivousingasupercharged protein.ACSChemBiol.2010；5(8):747-52)，成为迄今最强效的细胞转导/穿透元件。

CN105315377A公开了带有穿膜肽的天花粉(TCS)融合蛋白、质粒及制备方法与应用。 融合蛋白包括TCS与穿膜肽，所述的穿膜肽为人源性穿膜肽，选自ARF、HBD或TAT，所 述的融合蛋白中还含有连接肽，所述的连接肽为2个氨基酸到20个氨基酸长度的连接肽，优 选为柔性的连接肽。同时，可将带有穿膜肽的TCS融合蛋白用在制备抗肿瘤药物中。该发明 公开的带有穿膜肽的TCS融合蛋白对部分肿瘤细胞的穿膜能力仍然较弱，例如，该发明将人 超氧化物歧化酶C端部分氨基酸(HBD)作为穿膜肽与TCS融合，构建的融合蛋白对人肺 癌A549细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀)为3.8μM，用药剂量仍然较高，所以需要使TCS穿 膜能力更强的穿膜肽(细胞转导/穿透元件)，从而开发出用药剂量更低的TCS融合蛋白。

发明内容