[发明专利]一种组织不研磨直接提取核酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸提取技术领域，涉及核酸提取方法，特别涉及组织不研磨直接提取核酸的方法。

背景技术

核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。随着近年来分子生学技术的告诉发汗，以核酸杂交、核酸扩增和核酸序列分析为代表的分子诊断和检测技术在诸多领域中日益凸显出至关重要的作用。新型的分子生物学检测技术包括聚合酶链式反应(PCR)、微芯片、高通量测序等，然而，所有现代分子生物学检测技术首先面临的问题就是如何从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量和其完整性都会直接影响到随后的实验结果。目前，全世界的研究者在核酸分离提取的技术方法上也缺德了许多突破性的进展。自1869年被人类首次发现以来，许多研究正在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸提取的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲、盐酸胍等各种各样的化学试剂纷纷应用到核酸提取实验中。这期间具有里程碑意义的研究发现包括：1948年，Chargaff鞥人使用柠檬酸钠和RNase获得了具有天壤形状的DNA，1957年Kirby运用酚法抽提DNA，即向细胞裂解液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1体积)混合液，离心后收集上层水相并以异丙醇沉淀其中的核酸，经乙醇漂洗掉盐分后，使用TE等缓冲液或蒸馏水溶解制备DNA。1961年Mamur创建了十二烷基磺酸钠(SDS)法，最早用于提取细菌质粒DNA，该法的原理是基于共价闭合环状DNA保持双链的同时对高相对分子质量的细菌染色体DNA进行选择性的碱变性，使之与细菌蛋白以及破碎的细胞壁形成表面覆盖有十二烷基磺酸盐的复合物，离心后变性物质被去除，质粒DNA便可从上清中回收。1979年Chirgwin对前人的研究进行了系统的总结，创立了硫氰酸胍法提取RNA，异硫氰酸胍时一种强的蛋白变性剂，既可破裂细胞，也可以抑制核酸酶的作用，但该方法的操作较为繁琐，因此1987年Chomczynski和Sacchi在此 基础上开创了一步法提取RNA，提高了RNA提取的速度并因此得到了广泛的应用。伺候，有关核酸的提取方法仍在在不断地研究改进。自20世纪90年开起，为了适应现代分子生物学检测试验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要，运用磁珠提取核酸的方法应运而生了，该方法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他核酸提取方法无法比拟的优势，具有高通量操作、操作简单用时短、安全无毒和纯度高浓度大等优点。

核酸抽提是下游核酸检测、研究或产品开发的起点，所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果，因此核酸抽提时分子生物学最关键的方法之一。通常，成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，和蛋白的复合体的变形，核酸酶的灭活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖、脂和其他核酸污染。目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提出DNA、RNA或者总核酸。这些方法大多数已开成商业化的试剂盒，有的可以与仪器结合实现自动化抽提，从而使抽提过程大为简化。

核酸抽提方法主要包括：碱抽提法、酚氯法、高盐沉淀法、CTAB抽提法、硅介质柱法、离子交换法、磁性分离法等。

碱裂解法用于分离质粒DNA和大肠杆菌，在十二烷基磺酸钠存在情况下，该法可有效处理所有的大肠杆菌菌株和体积在1ml至500ml以上的细菌培养物。该法的原理是基于共价闭合环状DNA保持双链的同时对高分子量染色体DNA进行选择性的碱变性；细菌蛋白、破碎的细胞壁以及变性的染色体DNA形成表面覆盖有十二烷基磺酸盐的大的复合物；经离心，这些变性的物质背去除，质粒DNA便可从上清中回收。

酚-氯仿抽提法是核酸分离的一个经典方法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1体积)混合液，离心后收集上层水相并以异丙醇沉淀其中的DNA，乙醇漂洗掉盐分后弃去，TE缓冲液或蒸馏水溶解靶DNA。

异硫氰酸胍是一种强的蛋白变性剂，既可以破裂细胞，也可以抑制核酸酶的作用。异硫氰酸胍用于RNA抽提由Ulrich等(1977)首次提出。该法比较繁琐，已被Chomczynski和Sacchi(1987)发明的异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步 法所代替。一步法是用包含异硫氰酸胍、乙酸盐、酚和氯仿的酸性溶液抽提实现RNA与DNA的分离，最后以异丙醇沉淀回收水相中的总RNA。