[发明专利]鼻咽癌游离EBV-DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明实施例公开了一种鼻咽癌游离EBV‑DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法，其包括核酸释放剂，标准品，PCR反应液，EBV阳性对照，EBV阴性对照，所述核酸释放剂为Tris‑HCl和/或EDTA，所述标准品为包含EBV‑EBER区域为扩增区域的质粒。本试剂盒采用温和的化学裂解液来裂解测试样本中的核酸(DNA和RNA)，直接加入PCR反应液进行扩增，不需要提取游离EBV‑DNA及离心或其它处理，转变了EBV‑cfDNA检测先需抽提纯化的思维定式，检测范围为5.00E+08copies/mL～5.00E+01copies/mL，检测下限可达50copies/mL，检测结果准确，检测灵敏度高。

技术领域

本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及鼻咽癌游离EBV-DNA荧光PCR检测试剂盒及其使用方法，属于鼻咽癌体外诊断领域。

背景技术

鼻咽癌是华南和东南亚的高发肿瘤，具有种族和地域特性，我国主要集中在广东、广西、湖南、福建等华南省份，其发病率高达25/10万/年(25人每10万人每年)，平均死亡率达2.88/10万/年，在头颈部肿瘤中高居首位，严重危害人民生命健康。研究表明EB病毒感染与鼻咽癌密切相关。

EBV是一种疱疹类病毒，在人群的携带率高达90％，人一旦感染后，就可能终身携带，EBV主要感染人上皮细胞和B淋巴细胞。EBV可以通过唾沫传播，其感染途径一般为：首先在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞。这些被感染的B淋巴细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EBV活化形成复发感染。

目前，针对鼻咽癌的临床诊断主要依靠体格检查、纤维鼻咽镜、鼻咽部CT或MRI，远处转移主要依靠PET/CT、胸腹部CT或胸片、腹部B超、骨扫描等检查手段，但其项目繁多而费用昂贵，普适性较差，在此背景下，实验室诊断成为鼻咽癌诊断重要的组成部分。根据EBV与鼻咽癌的密切关系，检测人体中EBV的存在对鼻咽癌的早期诊断有很大的价值。由于EBV分离培养困难，目前临床一般用免疫学方法和分子生物学两种方法来辅助诊断，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或免疫组化法检测血浆中特异性EBV抗体，用PCR技术对样本中EBV-DNA载量进行检测，以确定EBV的感染。

血浆中游离的细胞外DNA(Cell-free DNA,cfDNA)最早发现于1948年，Mandel等人在健康人和患病个体中均发现了这些游离物质的存在，从而推翻了以往认为只有细胞中才含有遗传物质的观点。1977年，Leon首次发现肿瘤患者血清游离DNA显著高于正常人，由此开辟了游离DNA与恶性肿瘤关系研究的新领域。基于以上认识，结合EB病毒在鼻咽癌病因和发病中的特殊地位，Mutirangura运用巢式PCR技术在既往EB病毒感染的健康患者和确诊鼻咽癌患者的血浆中进行游离EBV-DNA(EBV-cfDNA)检测，前者均呈阴性，而后者血浆中则发现31％的检出率，统计显示，治疗前血浆EBVDNA的浓度与肿瘤细胞凋亡呈统计学正相关，提示血浆EBVDNA主要来源于肿瘤细胞凋亡，该研究首次揭示了外周血游离EBV-DNA和鼻咽癌的关系。chan进一步证实外周血EBV-DNA的10％-90％以82-181bp的小分子片段形式存在，并且这种小片段EBV-DNA占总EBV-DNA的比例与鼻咽癌癌体的大小以及是否复发转移有关，从而认为其成因是肿瘤细胞崩解后基因组DNA发生碎裂，并释放入血。总之，目前的观点认为治疗前外周血游离EBVDNA被认为和肿瘤的坏死、调亡和增殖均相关，可以间接反映体内肿瘤的负荷；治疗后外周血游离EBVDNA与病灶残留、复发或远处转移有关。

随着研究的进步，2013版《头颈部鳞癌综合治疗：中国专家共识》将血浆EBV-DNA载量检测作为鼻咽癌诊断和分期的指标之一。研究表明，鼻咽癌患者血浆EBV-DNA主要以细胞游离DNA(EBV-cfDNA)的形式存在，并且EBV-cfDNA已成为鼻咽癌特异性肿瘤标志物。