[发明专利]一种等温核酸扩增的方法

说明书

背景技术：

近年来，核酸扩增方法已得到广泛的关注。目前，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外扩增核酸序列最常用的方法。PCR方法使用少量双链核酸为模板实现指数式扩增，扩增结果使其具有高灵敏度的优点，因此该方法被广泛的用作克隆或核酸扩增的工具。然而，PCR方法明显存在以下问题：PCR的每一个循环都包括变性、退火和延伸这三个步骤，因此，必须要用具有精确调控温度的仪器，在医院的床边或户外难以应用；需要优化复性温度以提高特异性，工作较繁琐复杂；反应耗时长；因而满足不了即时检测领域中简单快速的要求。

为克服PCR方法存在的弊端，自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展一系列无需热变性的等温核酸扩增方法，如链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、交叉引物扩增(Cross Priming Amplification,CPA)等，这些方法的共同特点是扩增反应均在一个特定的温度下简单快速反应，从而大大的降低了对仪器的要求。

链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)是由沃克(Walker)等人于1992年开发的一种检测双链核酸扩增的方法。该方法主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶共同作用来完成的。其原理是首先使用热变性方法将双链DNA转变为单链，含有限制性内切酶识别序列的引物与单链模板结合，在DNA聚合酶作用下延伸形成模板的互补链，加入的外引物链置换下形成的模板互补链，另一个带有限制性酶识别序列的引物与形成的模板互补链结合并延伸，实验中采用硫代的特定碱基，使得内切酶切割双链中的一条链产生切口，聚合酶在切口处合成新的链并将原先的链置换下来同时补平酶切位点，被置换的链又与扩增引物互补而开启循环扩增。链置换扩增灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA，但是该方法需要初始热变性的步骤；反应还需限制性内切酶，增加了额外的费用，需要四条引物的参与，体系复杂易引起非特异性反应；检测手段的局限，限制了它的应用范围。

环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等人在2000年建立的一种新的体外扩增核酸特异性序列的方法，该方法主要利用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现核酸的快速等温扩增。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。该方法反应迅速，有较好的灵敏度和特异性。但是此方法四条引物设计比较困难，需要特殊的设计软件，对设计人员要求高，易引起气溶胶污染而导致假阳性结果，并且在检测中多用于定性而不是定量检测。上述不足在一定程度上限制了该技术的推广应用。

交叉引物扩增(Cross Priming Amplification,CPA)是一种恒温扩增靶核酸序列的方法。该方法主要针对靶基因的5个区域设计5条特异性引物，引物尾端交叉互换序列，利用具有链置换活性的DNA聚合酶进行延伸置换，以线性结构或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一模板上可有多个扩增反应同时进行，从而在恒温条件下完成核酸扩增反应，该方法的优点是不需要模板的热变性、多次温度循环过程，反应迅速等。然而，该方法引物比较多，易产生非特异性反应，得到的扩增产物复杂，只能通过琼脂糖凝胶电泳进行定性检测而不能进行定量分析。

发明内容

本发明提供一种等温核酸扩增的方法，来解决现有的等温核酸扩增的方法需要多引物、多酶、对小片段扩增效果差等问题。

本发明通过设计正向和反向两条引物，利用双链间的动态解离原理和链置换DNA聚合酶的作用在等温条件下实现信号的多重放大来完成核酸扩增反应，从而建立的一种新型的快速灵敏的核酸扩增方法。

本发明根据专利201510501218.X中提出Bst DNA聚合酶兼有反转录和链置换活性，可使RNA在其作用下首先反转录成cDNA，再利用Bst DNA聚合酶进行链置换扩增反应，使得整个体系完全在等温条件下进行RNA的扩增，无需额外加入反转录酶，使反转录与扩增实现一体化，减少了酶的用量，且大大缩短了反应时间，同时降低了反应的成本。

为了实现上述目的，一种等温核酸扩增的方法，包括以下步骤：

(1)设计正向和反向两条引物；