[发明专利]一种启动子批量捕获方法

说明书

本发明提供一种启动子批量捕获方法，所述方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA‑蛋白因子”的复合体，应用改进的染色体免疫共沉淀技术，把包含有未知植物基因启动子片段的DNA分拣出来。本发明利用蛋白因子OsTBP2和OsTFIIB紧密结合启动子上的TATA盒短链保守序列启动转录这一特性，通过生成这两种因子的特异性抗体，结合染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，专向捕捉未知植物基因启动子片段的技术。本技术利用大多数启动子都含有的一段TATA盒短链保守序列这一特点，结合近年来新开发的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)来分离未知的植物基因启动子片段的技术，比较容易实现植物启动子的大规模捕获，具有较高的商业价值。

技术领域

本发明涉及到生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种能够批量地从植物中捕获启动子的方法，该方法利用植物基因转录时在启动子区域所形成的“DNA-蛋白因子”的复合体，通过改进的染色体免疫共沉淀技术，使用复合体中蛋白因子的特异性抗体，从植物基因组分离未知的基因启动子片段。

背景技术

在植物的生长发育过程中，基因的调控序列即启动子对植物在不同的生长阶段里特定组织结构的形成和生长发育，以及对外界生物、非生物因子的胁迫应答都起着决定性的作用。启动子区域中的保守序列是转录因子的靶标，两者的特异结合是促进下游编码基因表达的重要环节，因此研究特定基因的调控首先要了解它的启动子。

大多数启动子都含有一些短链的保守序列，也叫做顺式作用元件。启动子上的TATA box，是许多通用转录因子的装配位点。TFIID因子对TATA box的识别是转录起始的第一步，转录因子TFIID的亚基TBP(TATA-binding protein)特异性识别和结合TATA box，然后促进其他转录因子结合，从而形成多因子的全酶-RNA聚合酶II。转录因子TFIIB是TFIID和RNA聚合酶的桥梁因子，能够富集高浓度的RNA聚合酶到启动子的周围，转录因子TFIID与TATA box结合后，转录因子TFIIB不对称的结合于TATA box的下游，决定转录起始位点，并保护起始位点附近的DNA模板链。同样地，在植物基因转录过程中，RNA聚合酶和一些转录因子，通过一系列复杂过程识别并结合到启动子区域中的保守序列上，组成转录起始复合物，由此推动目的基因以适当的强度，在特定的时间和空间表达基因产物。

自从进入21世纪以来，基因组的研究取得了长足的进步，基因数据库信息不断丰富，促进了功能基因和启动子的研究的发掘。然而相对于其它生物，对植物的基因发掘，在数量和质量方面还相当有限，远远不能满足作物分子育种的需求。尤其是对启动子的研究和发掘，大都基于对个别基因的分析认识，分离和表达等，难以做到规模化和系统化的开发。

现有技术中也存在着一些寻找植物基因中的启动子的方法，但是，现有技术中的方法往往是通过软件测算的估计启动子的可能存在，并不能直接一次性获得大量的启动子。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种能够批量捕获植物中各种未知启动子的方法。

本发明的目的是提供一种随机分离植物基因启动子片段的有效技术方法。

具体而言，本发明开发了水稻基因转录装置中的RNA聚合酶II型(Pol II)里面的DNA结合蛋白OsTBP2抗体和它的增强子OsTFIIB抗体。所述抗体能够有效结合到水稻基因启动子的转录调控位点TATA盒上。通过多聚甲醛对活体水稻幼苗的固定，用超声波对植物细胞的破碎，使用染色体免疫共沉淀手段，把DNA结合蛋白和含有TATA盒序列的启动子片段分拣出来。由于大部分的启动子都含有TATA盒序列，可以在分拣的DNA中获得多个启动子。然后克隆出分拣的启动子，在植物体内进行功能验证。本发明改变了常规手段对单个启动子的分离和获取。

植物基因启动子的高效获取手段通过如下方法实施：

所述OsTBP2和OsTFIIB抗体在ChIP新技术应用中，采取以下方案实施：