[发明专利]一种高效定点转基因的工具及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种高效定点转基因的工具。所述工具包含或可产生gRNA‑不具备内切酶活性的Cas9蛋白‑PB转座酶复合物，所述gRNA靶向基因组特定位点；所述不具备内切酶活性的Cas9蛋白为第十位氨基酸残基D突变为A、第840位氨基酸残基H突变为A的双突变Cas9蛋白。本发明通过设计靶向动物基因组的导向RNA(gRNA)，在gRNA与定点转座酶共表达情况下，PB转座酶随着CRISPR/cas9和gRNA的复合物靶向到基因组的特异位置，PB转座酶在特异的位点实现转座功能，如此同时共转染供体质粒(包含有外源目标基因的载体)，即可将外源的目标载体转座到基因组中特异性位点，从而实现定点转基因。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高效定点转基因的工具。

背景技术

定点转基因是将目的基因精确的整合到基因组的预定位置，可以有效的避免外源基因的随机整合，造成宿主基因的插入突变从而产生不可预知的影响。此外，外源基因整合到基因组中非活跃区受到位置效应影响导致外源基因表达量低或者表达完全沉默。通过基因组学研究以及生物信息分析，发现在动物基因组中存在一些基因表达的安全位点，外源基因整合到基因组中的该位点时，外源基因既不会影响动物本身基因组的稳定和安全，外源基因的表达也不会受到染色体状态影响。大量研究发现小鼠的ROSA26以及人AAVS1和hROSA26位点可作为转基因的安全位点。随着人类基因组研究进一步深入，越来越多的转基因安全位点将会被发现，应用于转基因动物制备或是细胞或者基因治疗。

怎样将外源的基因高效的整合到这些安全位点，一直是困扰科学家的难题。虽然利用基因打靶技术以及将外源基因精确的整合到基因组中的靶位点，但是同源重组的效率只有10^-7，且操作过程繁琐，劳动量巨大。最近发展ZFN、TALEN以及CRIPSR/Cas9基因编辑技术可以精确的切割动物细胞基因组DNA，可以人为制造细胞基因的插入或是缺失突变；虽然ZFN、TALEN、CRIPSR/Cas9切割基因组DNA，DNA双链断裂可以有效的提高同源重组效率，如果在供体模板DNA中插入外源基因也可以显著提高基因定点敲入的效率，但其本质仍然是同源重组，定点转基因效率仍然偏低。

CRISPR是在古细菌中发现的一种抵抗噬菌体入侵的免疫系统，近年来科学家根据CRISPR/Cas9的生物学特性，将其改造成为动物基因组DNA的基因编辑技术。

转座子是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程被称为转座。DNA转座子增效切离-粘贴机制，及在转座酶的催化下，DNA转座子从原始位置切离并插入到新的基因组位置。Piggbac(PB)转座子是一种能在哺乳动物细胞中发挥高效转座功能的DNA转座子，能将转座子基因随机插入到哺乳动物基因组中TTAA位点。PB转座子系统包含一个约为64kDa的转座酶，其供体质粒左端包含306bpPBL序列和右端包含237bpPBR序列。利用Piggbac转座子系统能够在动物细胞中实现高效的转基因，但是外源基因整合方式仍然为随机整合，因此实际应用中存在安全隐患。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种高效定点转基因的工具。

研究发现Cas9蛋白第十位氨基酸残基D突变为A，第840位氨基酸残基H突变为A(D10A和H840A)，双突变的CRISPR/Cas9系统能够根据导向RNA(gRNA)序列结合到基因组的特异性位点，但其内切酶活性完全消失，因此不能切割基因组DNA。

为了实现高效的定点转基因，本发明利用piggbac转基因效率高的优点，并且结合双突变CRISPR/cas9系统的靶向功能。利用基因工程技术，将二者融合成为一种能够实现高效定点转基因的DNA转座子系统。

具体而言，本发明的技术方案如下：