[发明专利]马铃薯卷叶病毒重组CP抗体在制备检测试纸条中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测马铃薯卷叶病毒的器具，特别是涉及马铃薯卷叶病毒重组CP抗体 在制备检测试纸条中的应用。

背景技术

马铃薯已成为世界第四大粮食作物，也是中国第四大主粮作物，现我国马铃薯种植面 积和产量均居世界首位，其对于我国的粮食安全具有重要作用。马铃薯卷叶病毒(potatoleaf rollvirusPLRV)是最重要的马铃薯病毒性病害，在所有种植马铃薯的国家发生非常普遍， 易感品种的产量损失可高达90％，一般减产40％-70％。该病毒通过蚜虫传播，也通过感染 病毒的块茎传播。病毒通过蚜虫以持久方式传播，其中桃蚜(Myzuspersicae)是最重要的 传播介体，还能通过嫁接传播，但不能经汁液机械接种传毒。PLRV自然寄主范围有限，20 多种可侵染的寄主植物主要为茄科植物，还有部分苋科、假茄科(Nolanaceae)、十字花科 和马齿苋科植物。病毒具有非常好的免疫原性，与属内的甜菜西方黄化病毒、甜菜轻型黄 化病毒以及黄症病毒科未归类的烟草坏死矮化病毒、菜豆卷叶病毒等有密切的血清学关系。 感染病毒植株初期症状：上部叶片卷曲，尤其是小叶的基部。这些叶片趋向于直立且一般 是淡黄色。对许多品种而言，它们的颜色可能是紫色、粉红色或红色。后期感染可能不会 有症状，而且有些品种感染后并没有症状。高感品种的块茎薯肉中有明显的坏死组织。当 年初次侵染的症状，主要表现病株顶部的幼嫩叶片直立变黄，小叶沿中脉向上卷曲，小叶 基部着有紫红色。续发性为二次侵染(即用上年PLRV初侵染块茎，在下年做种再发病)侵 染的病株症状，表现全植株病状较为严重，一般在马铃薯现蕾期以后，病株叶片由下部至 上部沿叶片中脉卷曲，呈匙状，叶肉变脆呈革质化，叶背又是出现紫红色，上部叶片褪绿， 重者全株叶片卷曲，整个植株矮化，块茎变瘦小，薯肉呈现锈色网纹斑。初侵染病株减产 程度小于续发性侵染病株。

病毒病素有“蔬菜癌症”之称，防治十分困难，已成为制约蔬菜产业、乃至主要农作物 发展的重要因素对病毒性危害，仅通过增加投入，像防治细菌和真菌病害那样大量使用农 药是无法控制的。培育抗性品种是减少病毒危害最有效的手段之一。但由于自然界缺乏抗 病毒种质资源，抗病毒育种将是一个长期和艰巨的攻关目标。进行种薯脱毒是大幅度提高 马铃薯生产水平的重要环节，也是投入少、见效快的途径之一。而脱毒种薯的脱毒标准和 质量则直接影响脱毒种薯应用和推广的成效，对此国内外已达成广泛共识。建立有效的马 铃薯病毒检测体系、完善检测技术对提高薯类作物的产量具有重要意义。马铃薯病毒检测 需要利用病毒分离鉴定、血清学检测和病毒核酸检测等实验室检测手段进行确切诊断。

目前实验室检测这三种病毒的方法有：(1)指示植物法的病毒分离与鉴定，PLRV采用 带病毒蚜虫接种洋酸浆或曼陀罗，其灵敏度高，但完成整个检测过程需1～2月，具有检 测周期长且技术要求高的局限性。(2)血清学检测主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、 酶联免疫吸附试验(ELISA)等。AGID试验操作简便、敏感性高、成本低，不需要复杂实 验设备，其缺点是有交叉反应。DAS-ELISA是PLRV血清学诊断首选方法，是最敏感和特 异的PLRV抗体检测技术，其缺点在于高亲和力单克隆抗体检测试剂不易获得。(3)用反 转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样品中的PLRV核酸，RT-PCR和实时荧光定量PCR 技术具有快速、特异、灵敏(以及定量)等特点，在PLRV核酸检测中得到广泛研究。 病毒分离与鉴定和PCR检测技术操作复杂、需要仪器和较长的时间，不适合生产或现场的 快速诊断需要。ELISA和AGID比病毒分离与鉴定和PCR技术简便、快速，常用来检测PLRV (ELISA)及其抗体，但仍不便于我国基层或现场普遍推广应用。因为ELISA仍需要酶标 仪和试剂，较复杂的操作步骤和经验，这些仪器、试剂在基层或者缺乏，或者缺乏操作人 员和保存条件。用斑点免疫金渗滤法即免疫试纸的方法检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓 缩和毛细管作用，将抗原－抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行， 并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况而判断结果，因此该法 比ELISA更简便、快速和实用。