[发明专利]一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)先分别将含黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液和含单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液置于90℃水浴中加热5分钟后，迅速置于冰浴中保持5分钟；分别取上述处理过的3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL混合，在37℃反应1h，形成杂交链Apt-ssDNA；

(2)向该杂交链Apt-ssDNA体系中加入待测样品，当待测样品中有黄曲霉毒素M1即AFM1时，Apt-ssDNA中的Apt选择性地与AFM1反应生成Apt-AFM1，同时释放出单链信号探针ssDNA；

(3)剩余Apt-ssDNA的去除：向步骤(2)体系中依次加入10μL扩增缓冲溶液、18μL浓度为10mM的dNTP溶液和2μL浓度为10u/μL的Phi29 DNA聚合酶溶液，在37℃下反应8分钟；体系中剩余的Apt-ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；接着再向该反应体系中加入2μL浓度为20u/μL的Exo III核酸外切酶溶液、5μL浓度为50mM的NH₄F溶液和5μL浓度为0.2 M的NaCl溶液，双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下迅速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来，从而消除剩余杂交链Apt-ssDNA的干扰；其中，所述扩增缓冲溶液组成为50mMTris-HCl、10mM MgCl₂和10mM(NH₄)₂SO₄，pH7.5；

(4)利用Apt-AFM1不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测银离子还原检测体系近红外荧光的强度，依据荧光强度与AFM1的量的关系，测定待测样品中的黄曲霉毒素M1即AFM1的含量；其中，所述银离子还原检测体系包括先后添加的150μL浓度为10mM pH为8的柠檬酸钠溶液、10μL浓度为2.5mM的银离子溶液和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的120μL浓度为1mM pH为8的+4价硫无机化合物还原剂溶液；

所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′；

所述单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3’。

2.一种检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其特征在于：它包括黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液、单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液、DNA扩增体系、核酸外切酶溶液和银离子还原检测体系；其中，所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液的黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的物质的量浓度、溶液体积与单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液的单链信号探针ssDNA的物质的量浓度、溶液体积均相同；

所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′；

所述单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3’；

所述DNA扩增体系包括扩增缓冲溶液、浓度为10mM的三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP、浓度为10u/μL的Phi29 DNA聚合酶溶液、浓度为50mM的NH₄F溶液和浓度为0.2M的NaCl溶液；其中，扩增缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂和10mM(NH₄)₂SO₄，pH7.5。

3.根据权利要求2所述检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其特征在于：所述核酸外切酶溶液是浓度为20u/μL的Exo III核酸外切酶溶液。

4.根据权利要求2所述检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，其特征在于：所述银离子还原检测体系包括先后添加的浓度为10mM pH为8的柠檬酸钠溶液、浓度为2.5mM的银离子溶液和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的浓度为1mM pH为8的+4价硫无机化合物还原剂溶液。