[发明专利]一种多功能化学交联剂及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种多功能化学交联剂，所述多功能化学交联剂是由两条反应官能团臂和一条包含亲和官能团和切割位点的臂组成的三臂式结构。本发明进一步提供了所述多功能化学交联剂的制备方法。本发明提供的多功能交联剂水溶性以及稳定性均十分优异，且交联效率高；将其应用于蛋白质分析时，不仅在简单体系如BSA、十个标准蛋白混合物的样品中展现出较好的交联肽段鉴定能力，而且在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，展现出很好的应用价值，为今后研究复杂生物体系蛋白相互作用提供一个强有力的工具。

技术领域

本发明涉及蛋白质及其功能研究领域，具体涉及一种多功能化学交联剂。

背景技术

蛋白质作为生命的物质基础和生命活动的主要承担者，研究蛋白质的功能对理解生命活动有重要意义。随着人类基因组计划的完成，过去十几年鉴定到的蛋白质数量急剧增加。然而，许多新发现的蛋白质的生理功能仍然不清楚，与研究蛋白质功能密切相关的是蛋白的三维结构以及蛋白-蛋白相互作用。传统的蛋白质结构解析方法X射线晶体学和核磁共振光谱学的分辨率可以达到原子水平。但是这两种方法都需要大量的蛋白质，而且对X射线晶体学而言获取质量很高的大分子量蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常困难的，核磁共振光谱学则要求蛋白质有较好的水溶性，且分子量一般低于30kDa。近年来兴起的一个完全不同的途径是化学交联－质谱鉴定技术。它在大约二十年前就已开辟，但近几年才发展成熟。该技术利用化学交联剂(chemical cross linker)在相互作用的蛋白之间形成依赖于某些类型的氨基酸残基及它们之间的空间距离的共价键，再通过质谱鉴定交联位点；所述整个流程包括(如图1所示)：1)蛋白质与交联剂发生特异性的交联反应；2)将蛋白酶切成肽段；3)质谱分析鉴定交联的肽段。新兴的单分子冷冻电镜－三维重构技术常常不能确定大分子量蛋白质或蛋白质复合体的局部构象，所以也往往与化学交联－质谱鉴定技术结合。

质谱技术的发展极大地推动了化学交联剂的应用，这使得它广泛应用于研究蛋白与蛋白的相互作用。这归功于质谱技术与化学交联剂的结合在研究蛋白与蛋白相互作用领域具有独特的优势，具体包括：1)化学交联剂与相互作用的蛋白质之间是通过不可逆的共价键连接的，理论上可以检测到其它方法很难捕获的瞬时相互作用；2)由于质谱直接分析的是蛋白质水解后的多肽，因此蛋白质或蛋白复合物的大小是不受限制的；3)分析速度快，对样品纯度要求低，而且需要的蛋白在微克级别，具有很高的灵敏度；4)可供选择的化学交联剂种类很多，根据两个反应官能团的差别可分为：氨基—氨基，氨基—巯基，巯基—巯基，巯基—羧基；同时两个反应官能团之间的臂长也可以改变。

尽管已经有很多商业化的化学交联剂，但是由于酶切产物大部分都是普通肽段，而交联肽段所占比例很低，因此在如此复杂的体系中去鉴定交联肽段是一项非常困难的任务。目前大部分交联剂仅仅停留在简单、纯化的蛋白样品分析，对复杂的生物样品并没能显现出太大的解决能力。通过使用生物素对样品进行纯化富集可以实现交联肽段与普通肽段的分离，这将大大减低样品的复杂程度，因此可富集型交联剂是当前发展的重点。同时，在交联剂中引入可切割位点有利于交联肽段在富集中从固相系统上释放，而同位素的引入不仅能帮助交联肽段的鉴定，更使得交联肽段的定量成为可能。然而，简单机械地将这些官能团拼凑在一起有时并不能实现它们自身的价值，不当的累加反而带来负面效果，导致交联剂水溶性降低、交联效率不高、稳定性不好等问题。因此，如何将这些官能团有机地融合在一起，使它们发挥出自身的功能，成为能解决复杂生物样品分析的化学交联剂仍是一个巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种能解决复杂生物样品分析的多功能化学交联剂。本发明提供的多功能化学交联剂是由两条反应官能团臂和一条包含亲和官能团和切割位点的臂组成的三臂式结构，其交联效率高，水溶性以及稳定性均十分优异，尤其对于复杂生物样品进行分析时可以充分发挥其优异的交联效果。

具体而言，本发明提供的多功能化学交联剂具有如下通式的结构：