[发明专利]一种提取2′，3′-环形核苷单磷酸的方法

权利要求书

1.一种提取2', 3'-环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：

（1）提取大肠埃希氏菌（Escherichia coli）K12菌株的基因组DNA，利用PCR扩增编码IF3蛋白的基因if3，制得基因if3；

所述PCR特异引物序列如下：

F: GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，

R: CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；

（2）将步骤（1）制得的基因if3酶切后与同样经酶切的表达质粒PET-22b连接，然后转化到E.coli BL21（DE3）菌株中，进行发酵培养，制得重组菌发酵液；

（3）分离步骤（2）制得的重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3，然后0℃静置2.5～3.5 d，固液分离，取上清液；

（4）将步骤（3）制得的上清液经超滤去除蛋白杂质，滤液经C₁₈反向色谱柱进行高效液相分离，分别制得含四种2', 3'-环形核苷单磷酸溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的PCR扩增体系如下：

灭菌蒸馏水 32.2 μL

5×TransStart FastPfu 缓冲液 10 μL

dNTP 混合物 5 μL

50 μM引物F 0.4 μL

50 μM引物R 0.4 μL

基因组 DNA 1 μL

TransStart FastPfu DNA 聚合酶 1 μL

PCR反应条件如下：

95℃预变性5 min；95℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，30个循环；72℃终延伸5 min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中酶切采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切反应体系如下：

缓冲液 2 μL

表达质粒PET-22b或基因if3 8 μL

限制性内切酶NdeI 1 μL

限制性内切酶XhoI 1 μL

灭菌蒸馏水 8 μL

反应条件：37℃温浴30 min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中连接的反应体系如下：

酶切后的载体pET-22b 1 μL

酶切后的基因if3 4 μL

Solution I 5 μL

反应条件：16℃连接过夜。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵培养步骤如下：

先在35～38℃、150～200 rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600 nm吸光度为0.8；然后在18～22℃、100～140 rpm继续培养30 min；再加入终浓度为0.1 mM的IPTG，继续诱导培养22～25小时；

所述发酵培养基为淡水LB培养基，组分如下：

10 g NaCl，10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，pH 8.0，蒸馏水定容至1 L。