[发明专利]植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，是对植物基因进行编辑的Cas9蛋白变体VQR及其编码 基因的应用。

背景技术

近年来，CRISPR-Cas9以其高效、简便的技术特点，在植物中迅速成为最为重要的 基因组编辑手段。CRISPR-Cas原为广泛分布存在于原核生物中的免疫系统，CRISPRs (Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)即规律成簇间隔短回 文重复，Cas蛋白则是一种受RNA引导的核酸酶。

目前所使用的CRISPR-Cas9系统，是基于II型CRISPR-Cas所开发的基因组编辑技 术。该技术所涉及到的Cas蛋白仅有Cas9一种，受tracrRNA和crRNA组成的引导RNA(后被优 化为sgRNA)所引导，Cas9蛋白的HNH结构域及RuvC结构域在PAMs(protospaceradjacent motifs)序列上游的3-8bp处进行双链切割并造成双链断裂。当双链断裂发生，细胞便会启 动两套修复机制，即非同源末端链接(Non-homologousending-joining，NHEJ)与同源重组 (Homologousrecombination，HR)。非同源末端链接通常造成双链断裂处产生单个或多个 碱基的缺失、插入，以该方式修复的个体常常产生某个基因的定点突变。同源重组则是以同 源序列作为模板，进行高保真修复。

在CRISPR/Cas9系统中，前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif， PAM)序列决定了整个基因组中靶序列的分布。PAM是位于目标DNA附近的一段序列，具有识 别靶DNA的功能，只有当正确结合PAM序列时，才能活化Cas9的两个内切酶活性区。靶序列末 端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点，是实现剪切功能的关键。然而这并不 能完全满足人们对于植物基因编辑范围的需求。由于CRISPR-Cas9系统靶位点的选择受到 PAM序列NGG的限制，因此在植物中发现及改造能识别新PAM的Cas9变体变得十分重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型植物Cas9变体蛋白VQR及其编码基因和 应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物Cas9变体蛋白VQR，该蛋白质的氨基 酸序列如SEQIDNo：2所示。

作为本发明的植物Cas9变体蛋白VQR的改进：所述蛋白质还包括在SEQIDNO：2所 示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明还同时提供了一种植物Cas9变体基因VQR，该基因编码植物Cas9变体蛋白 VQR，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

作为本发明的植物Cas9变体基因VQR的改进：所述基因还包括在SEQIDNO：1所示 的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生 物。

本发明还同时提供了一种重组表达载体，包含上述基因。

本发明还同时提供了上述植物Cas9变体蛋白VQR的用途，其特征是：能够在PAM区 为5’-NGA-3’的情况下实现基因组编辑功能。N代表A,T,C,G任意一种核苷酸。

本发明的方案具体如下：

本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同活性功能由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述基因是如下(1)-(3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列；

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。