[发明专利]一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，属于生物技术领域。

背景技术

乌桕(Sapium sebiferum)为大戟科乌桕属多年生木本植物，广泛分布于我国热带和亚热带地区，为我国特有经济树种。乌桕树冠整齐，叶形秀丽，秋叶鲜红、紫色或鲜黄色，集观形、叶、果于一体，具有非常高的观赏价值，可作庭院绿化及行道树。此外，乌桕适应性较强，对土质要求不高，耐旱、涝、贫瘠、适宜边际土地种植，且种植模式多样，易于实现大面积规模化生产。因此，乌桕无论是作为观赏树种，还是荒山滩涂绿化树种均已引起广泛关注。但乌桕作为景观或滩涂绿化树种，普遍存在枝条稀疏，树型中空的问题，在一定程度上限制了乌桕的应用。

三倍体育种培育是植物种质创新的重要途径，在其遗传学和育种学领域具有重要的意义。三倍体植物通常具有生长迅速、生长旺盛、抗逆性强、无籽等优良性状。相对于传统的借助杂交技术创制三倍体而言，通过胚乳离体再生三倍体具有周期短、效率高等优点；同时，由于胚乳细胞的染色体2/3来自母本，1/3来自父本，作为研究性状遗传规律的材料，也颇具价值；此外，胚乳细胞在形成三倍体植株的同时，可以产生大量不同倍性的混合体和非整倍体，可为育种提供丰富的不同倍性材料。因此，通过胚乳培养获得营养生长旺盛的乌桕多倍体植株，可以克服乌桕在景观和绿化应用上的不足。

目前，关于利用乌桕胚乳为外植体，对乌桕进行离体再生的研究也有报道，但主要集中在通过愈伤组织的诱导和分化来进行植株再生研究，存在再生效率低，再生过程繁琐等问题，很难满足乌桕多倍体育种的需求。因此，针对当前乌桕胚乳倍性育种所存在的问题，急需开发一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，以满足乌桕倍性育种的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法。为实现乌桕的倍性育种和后期的遗传改良研究奠定基础。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种乌桕成熟胚乳离体直接再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)取乌桕成熟种子剪去种壳，经表面消毒后接种于添加生长调节剂的启培养基中，光照，进行胚乳启动培养；

(2)把胚乳从乌桕种子上剥离，接种于不定芽诱导培养基中，光照，进行不定芽的诱导，获得嫩绿不定芽丛；

(3)将不定芽丛切块，转接于增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长；

(4)转入生根培养基进行生根，获得健壮的乌桕试管苗，驯化后进行移栽。

优选地：所述步骤(1)的光照时间为6～9d；所述步骤(2)的光照时间为2～3周；所述步骤(4)中，培养3～4周后获得乌桕试管苗。

优选地：所述步骤(4)中，待芽长至2～3cm并伴有2～3个叶片时，再转入生根培养基进行生根。

优选地：所述步骤(1)的表面消毒是指在无菌操作台中，用75％的无水乙醇消毒30～45s，之后用20％的次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗3～5遍，之后再经600W超声处理7～10min，种子表面消毒期间不停地摇动。

优选地：所述步骤(1)的乌桕启动培养基为包括有2.0～8.0mg/L 6-BA、0.2～1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。

优选地：所述乌桕胚乳来源于经过预培养6～9d，处于萌动状态的乌桕种子。

优选地：所述步骤(2)的不定芽诱导培养基为包括有3.0～6.0mg/L 6-BA、0.05～0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。

优选地：所述步骤(3)的切块是指将胚乳丛生芽增殖前切成(0.2～0.4)×(0.3～0.5)cm²大小的切块。

优选地：所述步骤(3)的增殖和伸长培养基为包括有1.0～2.0mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂的MS培养基。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

(1)再生过程简单，不经过愈伤组织的诱导阶段，可以在胚乳周边表皮直接诱导出不定芽丛；

(2)进一步，本发明中采用次氯酸钠与超声结合的方法对乌桕种子进行消毒，具有消毒时间短，消毒效果好，污染率为0％；同时，可以促进种子的萌动和后期胚乳的再生等优势；

(3)进一步，不定芽再生速度快，胚乳经过6～9d的启动培养和2～3周的诱导培养，即可再生出大量的不定芽(每个胚乳20～40个)；

(4)再生频率高，胚乳不定芽的诱导率高达100％。