[发明专利]一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法

权利要求书

1.一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，依次包括：乌桕茎尖剥取、预培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤；

所述的预培养是指：将剥取的茎尖接种于添加有0.2-0.5M蔗糖的MS固体培养上，于25±2℃的恒温培养室黑暗培养1-5d；

所述的装载具体是指：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理10-60min；所述的装载液的组成为：MS+2M甘油+0.4M蔗糖；

所述的玻璃化处理具体是指：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理1-4h；所述的PVS2溶液的组成为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖；

所述的卸载是指：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和洗涤；所述的卸载液的组分为：MS+1.2M蔗糖；所述的卸载和洗涤条件为：室温下洗涤茎尖2-3次，每次洗涤时间5-10min；

所述的恢复培养具体是指：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；所述的恢复培养基为MS+0.5-2.0mg/L6-BA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8；所述的恢复培养条件为：25±2℃的恒温培养室黑暗培养7d,最后转至光照强度为40μmolm^-2s^-2,光照时间为14h的条件下进行植株再生。

2.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的乌桕茎尖剥取具体是指：在无菌条件下，从乌桕植株茎段诱导的不定芽丛上剥取带有2-3个叶原基，直径大小约为2-3mm的离体茎尖。

3.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的小液滴制作具体是指：将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上,并向每个茎尖滴加8-10μLPVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放5-6个茎尖。

4.根据权利要求1所述的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于，所述的超低温冷冻保存具体是指：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存。