[发明专利]检测艾滋病治疗药物非核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用

说明书

本发明涉及用于检测艾滋病治疗药物非核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，包括检测HIV‑1病毒pol基因的突变位点K103N、V108I、E138A、Y181C、Y188C、G190A、G190R和M230I的ASPCR引物，每个突变位点的上游引物分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，下游引物均为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。本发明用于对艾滋病治疗药物NNRTIs耐药突变位点进行特异性扩增，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低的优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物非核苷类逆转录酶抑制剂的主要耐药突变的引物。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种传染病，HIV病毒破坏感染者免疫系统，最终出现各种机会性感染和肿瘤。根据HIV基因的差异，可分为HIV-1及HIV-2两型，以HIV-1感染为主。

目前艾滋病尚无治愈的方法，最常用的是高效联合抗逆转录病毒疗法(HAART)，能有效抑制病毒复制，将感染者体内病毒含量控制在现有方法检测不到的水平。现有抗病毒药物至少6类34种，包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)、融合抑制剂(FIs)、病毒进入抑制剂(EIs)、整合酶抑制剂(INs)。

我国政府免费提供的抗病毒药物共有3类9种，包括5种NRTIs、2种NNRTIs以及2种PIs，一线抗病毒治疗方案一般由2种NRTIs和1种NNRTIs组成。治疗过程中，以下原因共同作用导致耐药的产生：(1)HIV-1快速复制且逆转录酶缺乏校读功能，复制过程中保真性差，基因序列产生大量突变；(2)药物药效学及药代动力学的影响；(3)宿主的遗传因素及依从性。在药物选择压力作用下，含耐药突变的毒株逐渐成为优势毒株，对治疗药物敏感性降低，导致病毒抑制不完全或抗病毒治疗失败。

目前HIV耐药性检测方法主要分为基因型检测和表型检测，表型检测是HIV-1耐药检测的金标准，测定在药物存在的情况下对HIV-1复制影响，需从患者体内分离病毒并感染外周血单核细胞，测定药物半数抑制浓度(IC₅₀)评价耐药性。实验过程技术要求高、周期长、价格昂贵，一般用于评价病毒对新药物敏感性或耐药位点对药物敏感性的影响。

基因型检测是通过测序获得病毒的基因序列，分析序列中是否存在耐药相关突变来判断毒株耐药情况。该方法涉及病毒RNA提取、逆转录、PCR扩增、测序、序列分析等步骤，具有操作简单、成本较低等特点，是目前耐药监测中常用的方法。但基因型检测也存在一定的局限性：(1)实验室不能独立完成整个实验过程，PCR扩增后的产物需送测序公司测序，使实验周期长，对临床应用有一定限制；(2)传统Sanger测序得到的是准种的共同序列，对于含量低于20％的劣势毒株则无法检测，损失部分低丰度耐药毒株的序列信息。因此，需建立操作简单、分析周期短、结果准确、成本低的耐药检测方法，用于大规模耐药监测。

等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,ASPCR)是一种SNP分型的方法，一个SNP位点包括两条特异性引物和一条通用引物，两条特异性引物的3’末端分别与SNP两个等位基因的碱基配对，特异性引物能够扩增与之配对的基因型但不能扩增与之错配的基因型，因此通过PCR扩增的结果可以判断SNP类型。

然而，目前尚未有人设计ASPCR引物来检测艾滋病治疗药物非核苷类逆转录酶抑制剂的主要耐药突变。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提供一种应用PCR方法快速、灵敏检测艾滋病治疗药物非核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物及其应用。