[发明专利]一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及山核桃无性栽培的技术领域，特别涉及一种山核桃Aux/IAA基 因克隆的分析方法。

【背景技术】

山核桃是山区农民脱贫致富的主要经济树种，具有童期较长，不容易采收， 树体高大以及园艺化栽培等困难，阻碍了山核桃的产业发展。植物嫁接手段是 植物无性繁殖里面比较重要的栽培技术，也是解决山核桃优良种质及园艺栽培 的重要手段。

植物生长素IAA是一种植物中重要的生长调节分子，主要参与植物根茎叶 的生长和发育，维持植物顶端优势，维管束的形成与分化，植物的向性运动等 诸多过程，在植物的整个生命周期都起着重要的作用。Aux/IAA蛋白是调节生 长素IAA的表达转录因子，主要编码一种通过生长素的诱导来表达的组织或发 育阶段特异性的基因家族。Aux/IAA的启动子元件能和生长素IAA的响应因子 ARF特异结合形成二聚体，然后激活或者抑制基因的表达。

目前，根据对杨树、拟南芥等植物的突变体的Aux/IAA调控机制的了解， 不论是外界的环境因子还是植物的生长激素都能够对Aux/IAA的功能产生重要 的作用，为了更深入的了解和分析山核桃无性栽培的技术中Aux/IAA的功能， 有必要提出一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，利用分子生物学手段分 析山核桃Aux/IAA基因在其嫁接过程中的生物学功能，阐明可能的作用机制， 通过对生长素原初响应基因CcIAA的克隆，分析山核桃的嫁接调控的机理以及 该基因和生长素的信号传导途径的关系，有利于更进一步了解Aux/IAA对山核 桃的嫁接成活率影响作用机制以及山核桃嫁接过程中生长素的信号转导机制。

【发明内容】

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种山核桃Aux/IAA基 因克隆的分析方法，其旨在解决现有技术中对于Aux/IAA对山核桃的嫁接成活 率影响作用机制以及山核桃嫁接过程中生长素的信号转导机制的了解及分析并 不深入，山核桃嫁接成活率较低的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法， 包括如下步骤：

步骤一、仪器准备：液氮罐、高速冷冻离心机、灭菌锅、超级纯水仪、电 热恒温水箱、超级低温冰箱、紫外分光光度计、PCR仪、通风橱、电泳槽、小 型涡旋仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、 转膜仪、烧杯、天平、移液管、研钵研棒和荧光实时定量PCR仪；

步骤二、植物材料准备：用于山核桃Aux/IAA基因克隆的实验样品，选取 山核桃的嫁接枝条进行采集，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，用作样品 并存放入-70℃环境中备用；用于qRT-PCR和Westernblot的样品，选取长势相 似的两年生的实生苗砧木和留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生苗的 接穗，并在实验基地中完成嫁接，采用两种不同的生长激素：IAA4mg/l，NPA 0.3ug/l来处理山核桃接穗，时间为30min，砧木用蘸有激素的毛笔蘸湿。对照组 用清水处理。在山核桃嫁接之后0天，1天，3天，5天，7天，14天采样，共 有36个不同的样品，我们对每一个样品准备25个重复并用锡箔纸包好后立即 放入液氮中，并存放于-70℃保存后备用。

样品编号如下：

对照组接穗：j0，j1，j3，j5，j7，j14；

对照组砧木：z0，z1，z3，z5，z7，z14；

IAA处理接穗：Ij0，Ij1，Ij3，Ij5，Ij7，Ij14；

IAA处理砧木：Iz0，Iz1，Iz3，Iz5，Iz7，Iz1；

NPA处理接穗：Nj0，Nj1，Nj3，Nj5，Nj7，Nj14；

NPA处理砧木：Nz0，Nz1，Nz3，Nz5，Nz7，Nz14；

步骤三、总RNA提取并检测：在实验室中，对经步骤二采集后的嫁接枝条 样品进行总RNA的提取，获得嫁接枝条样品的总RNA提取液，并从总RNA的 提取液中吸取2ul进行OD值测定，检测质量与浓度，从总RNA的提取液中吸 取4ul与Buffer混匀后进行电泳检测；

步骤四、Aux/IAA基因的RACE扩增：步骤如下：

1)RACE引物设计：利用山核桃454测序数据库，找到一个320bp的生长 素IAA基因，运用PrimerPremier5.0软件进行引物设计，引物如下：