[发明专利]一种基于组胺受体3分子探针的药物活性成分筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种基于组胺受体3分子 探针的药物活性成分筛选方法。

背景技术

常规的细胞水平、动物水平的药物筛选方法不仅费时、费力，而 且容易受到多重因素的干扰，假阳性、假阴性率较高，也很难确定药 物作用的靶点，并且需要大量的被筛选化合物。近十年来，随着生物 检测技术和计算机技术的快速发展，分子水平的药物筛选方法不断涌 现，如：表面等离子体共振法、核磁共振法、下游信号分子检测法、 荧光偏振法、虚拟筛选法等等，每种方法有自己的优缺点，都属于间 接的筛选方法。至今还没有以受体空间构象变化为指针，可以直接、 实时监测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于组胺受体3分子探针的药物活 性成分筛选方法，根据受体空间构象变化为指针，可以直接、实时监 测受体对药物反应的高灵敏度的筛选法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种基 于组胺受体3分子探针的药物活性成分筛选方法，筛选方法包括了以 下步骤：

步骤1：构建组胺受体3分子探针：

A.采用Clontech试剂盒，将人组胺受体3的cDNA连接到实验室现 有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP上，从而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV- 组胺受体3-eCFP质粒；

B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中 部，从而得原始的分子探针质粒；

C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针， 并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测 探针的灵敏度；

D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；

步骤2：建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-InT-Rex HEK293细胞系：

A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-InT-Rex HEK293细胞,并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；

B.用1ug/mlDoxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受 体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测 分子探针的细胞定位；

C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-InT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停 止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。

其中，步骤1中对探针进行结构优化具体如下：

调整eYFP在受体第三内环的位置：将受体第三内环分别截短至 两端各保留12个氨基酸，优化前探针的eYFP位于受体第三内环的中 间位置，优化后探针的eYFP位于受体第三内环的230-347位置，eCFP 位于受体C-末端的445位置。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明采用荧光共振能量转移的方法建立了组胺受体3分子探针， 该分子探针具有高灵敏度，低噪音，高通量的特点，不仅能筛选受体 激动剂也能筛选拮抗剂/反向激动剂，并且筛选过程不受下游信号的 干扰。

2.经过合理设计的分子探针能够对中药混合物进行筛选，能一步到位 的在受体水平上筛选到分子作用靶点明确的先导化合物。

附图说明

图1为本发明分子探针的结构示意图。

图2为本发明实施例2的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

如图1所示，本发明公开了一种基于组胺受体3分子探针的药物 活性成分筛选方法，筛选方法包括了以下步骤：

步骤1：构建组胺受体3分子探针：

A.采用Clontech试剂盒，将人组胺受体3的cDNA连接到实验 室现有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP上，从而得到 pcDNA5/FRT/TO-VSV-组胺受体3-eCFP质粒；

B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中 部，从而得原始的分子探针质粒；