[发明专利]一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法，其是从含ASFVP30全长基因的质粒PCR‑4TOPO‑P30中扩增出P30基因，将扩增的P30基因连接至杆状病毒载体pFastBac 1中，构建重组杆状病毒载体pFastBac1‑ASFV‑P30，转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，获得重组穿梭杆粒rBacmid‑ASFV‑P30，鉴定正确后将其转染至Sf 9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并将重组杆状病毒进行传代扩增，将高滴度的含有ASFV P30基因的杆状病毒接到High Five昆虫细胞中进行ASFV P30蛋白的真核表达。选用本发明方法构建非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体，并利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白，为非洲猪瘟血清学ELISA检测方法的建立奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术中基因重组表达领域，特别涉及一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是猪的一种急性、高度接触性和高度致死性地传染性疾病，由非洲猪瘟病毒(African swine fever vires.ASFV)引起，强毒株感染猪的致死率高达100％。本病最初发现于肯尼亚，后来疫情在非洲、欧洲等国家扩散传播，近年来，该病的流行范围扩大蔓延至格鲁吉亚、俄罗斯等周边国家。在中国，养猪业的发展正面临着巨大的威胁。ASFV储存宿主和媒介是软蜱和非洲野猪，该病的感染和逃逸免疫机理非常复杂，目前还没有能防治的疫苗，为了避免非洲猪瘟在我国突然暴发，必须建立一种快速而又能准确检测诊断本病的方法。

P30是ASFV的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，由CP204L基因编码，有强的免疫原决定簇，可作为体液免疫反应中非常有效的诱导蛋白，并且在感染后的早期表达和分泌，常被用于感染后免疫反应的早期检测，与其他ELISA方法相比，基于P30的ELISA方法可以提前一周检测到ASFV特异性抗体。

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，该真核表达系统的受体是昆虫细胞或活体昆虫。杆状病毒表达系统具有的相对于其他表达系统更为特殊的优势是作为表达载体的杆状病毒基因组可以容纳更多外源基因；在昆虫细胞中进行蛋白的表达，能够很好地加工修饰外源蛋白；杆状病毒一般只感染节肢动物，对人和牲畜没有迫害。我国是国际上生猪存栏及其消费数量最大的国家，“猪粮安天下”，生猪养殖业的健康发展将对于我国的食品卫生安全和国家稳定安全具有极为重要的意义，因此我国必须要加强对该病监测防控，尽快建立对于非洲猪瘟相应的血清学检测方法，而且可以确定该检测方法是具有安全性、可靠性、适合推广性，那么它将对于防止非洲猪瘟侵入我国、保障我国生猪养殖业的健康发展具有十分重要的现实意义。本发明通过构建含ASFVP30的重组杆状病毒载体，并利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了非洲猪瘟P30蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的非洲猪瘟血清学检测方法奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30重组蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的非洲猪瘟血清学检测方法奠定基础，对防止非洲猪瘟的传入和控制具有重要的现实意义。

本发明的目的之一是提供非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体，其特征在于该重组杆状病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

进一步地，其所述非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体特征包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述昆虫杆状病毒表面展示有非洲猪瘟P30蛋白。

所述非洲猪瘟P30蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的是提供非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其具体制备步骤包括：(1)构建重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30和重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30；和(2)在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白。