[发明专利]一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌及其构建方法与应用

权利要求书

1. 一种利用木糖生产乙醇酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是通过在E.coliBL21（DE3）中过表达木糖脱氢酶基因，木糖酸内酯酶基因，木糖酸脱水酶基因，3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因和乙醇醛脱氢酶基因制备获得的；所述木糖脱氢酶基因，为来源于新月丙杆菌（Caulobacter crescentus）的木糖脱氢酶基因 xylB；所述木糖酸内酯酶基因，为来源于新月丙杆菌（Caulobacter crescentus）的D-木糖内酯酶基因xylC；所述木糖酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的木糖酸脱水酶基因yjhG；所述3-脱氧-D-甘油戊酮糖酸醛缩酶基因，为来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的2-脱氢-3-脱氧-D-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH；所述乙醇醛脱氢酶基因，为来源于大肠杆菌（Escherichiacoli）的醛脱氢酶基因aldA；

所述木糖脱氢酶基因xylB ，Gene ID: 7329904，是以 C. crescentus为模板，通过PCR 扩增获得，引物序列为：xdh-F 5'-GGGAATTCCATATGTCCTCAGCCATCTATCCC-3'，xdh-R5'-CGGGGTACCTCAACGCCAGCCGGCGTCGAT-3'；

所述D-木糖内酯酶基因xylC，Gene ID: 7329903，是以 C. crescentus为模板，通过PCR 扩增获得，引物序列为：xylC-F 5'-CCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAATTG-3'，

xylC-R 5'- AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAACCAGACGAACTTCGTGCTG-3'；

所述木糖酸脱水酶基因yjhG，Gene ID: 946829，是以 E.coli为模板，通过 PCR 扩增获得，引物序列为：yjhG-F 5'- GGAATTCCATATGTCTGTTCGCAATATTTTTGC-3'，yjhG-R 5'-CCGCTCGAGTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCG-3'；

所述2-脱氢3-脱氧-D-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH，Gene ID: 948825，是以 E.coli为模板，通过 PCR 扩增获得，引物序列为：yjhH-F 5'- CCGCCATGGCATGAAAAAATTCAGCGGCAT-3'，yjhH-R 5'- CCGGAATTCTCAGACTGGTAAAATGCCCT-3'；

所述醛脱氢酶基因aldA，Gene ID: 945672，是以 E.coli为模板，通过 PCR 扩增获得，引物序列为：aldA-F 5'- CCGCCATGGGATGTCAGTACCCGTTCAACA-3'，aldA-R 5'-CCGGAATTCTTAAGACTGTAAATAAACCA-3'。

2.权利要求1所述的重组菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以新月柄杆菌的基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖脱氢酶基因xylB ，D-木糖内酯酶基因xylC；以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，设计引物分别克隆木糖酸脱水酶基因yjhG，2-脱氢-3-脱氧-D-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH和醛脱氢酶基因aldA；

2）将步骤1）所得的木糖脱氢酶基因xylB，D-木糖内酯酶基因xylC和2-脱氢-3-脱氧-D-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH连接到质粒pETDuet-1上，获得重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC；

3）将步骤1）木糖酸脱水酶基因yjhG和醛脱氢酶基因aldA连接到质粒pACYCDuet-1上，获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG；

4）将步骤2）所得的重组质粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，将步骤3）获得重组质粒pACYCDuet-1-aldA-yjhG同时导入受体细胞E.coli BL21（DE3），获得重组菌。

3.权利要求1所述重组菌在利用木糖发酵生产乙醇酸中的应用。