[发明专利]一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种生产3‑羟基丙酸的重组大肠杆菌及应用，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α‑酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；通过利用基因敲除技术解除甘油进出细胞的抑制，同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD⁺，从而提高3‑HP产量，提高了12倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种3-羟基丙酸的制备方法，特别涉及一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其制备方法和应用。

(二)背景技术

由于煤炭石油等不可再生资源日益减少，潜力巨大的燃油生物炼制技术受到越来越多的关注，其中，生物柴油产业更是在近几年内迅速发展。然而，每生产10吨生物柴油就会产生1吨甘油。甘油的生产增长迅速，致使甘油价格一路走低。充分利用来源丰富、价格低廉的甘油，可以带来巨大的经济效益和环境效益。

3-羟基丙酸(3-HP，C₃H₆O₃)与乳酸为同分异构体，是一种重要的平台化合物，它无色、无味，可以与水、醇、醚等多种溶剂互溶。由于具有羟基和羧基两个活性基团，因而在化学反应中是多种化工原料的合成前体，也是构成很多高分子的单体，例如3-HP能够脱水生成丙烯酸，氧化即成丙二酸，还原生成1,3-丙二醇，而这些都是重要的化工和日用品原料。由于3-HP显著的市场价值及工业应用前景，2004年美国能源部报告将3-HP列为当今世界上12种最具有开发潜力的化工产品之一。

目前，3-羟基丙酸的生产方法是化学合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯氰转化法。但在碳末端引入功能团有很大的难度，且其产品不易分离提纯，生产成本较高，生产过程存在不安全因素，而微生物发酵方法生产3-HP可以有效的避免这些不利因素。相比化学合成法，生物合成具有操作简便、条件温和、绿色环保的优点，因而越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。

微生物产3-HP早在上世纪60年代就有报道，但是天然存在的菌株所需底物价格高且3-HP产率都比较低，因此长期处于实验室阶段。近年来，随着分子生物学技术的发展，大量研究开始集中于对天然菌株进行途径改造，利用重组菌以甘油或葡萄糖等廉价碳源为底物生产3-HP。基因工程菌的构建按照底物的不同主要分为以葡萄糖为底物和以甘油底物两种。葡萄糖为底物的转化路线以美国Cargill公司的研究最为成熟，该公司构建了多条从葡萄糖到3-HP的路径，其中最具有代表性的过程为：葡萄糖经酵解途径到丙酮酸，丙酮酸还原生成乳酸，乳酸在丙酰辅酶A转移酶的作用下生成乳酰辅酶A，后者在乳酰辅酶A脱水酶作用下生成丙酰辅酶A，进而在3-羟基丙酰脱水酶的作用下，生成3-羟基丙酰辅酶A，最终生成3-HP。

以甘油为底物生成3-HP通常有两步反应组成：甘油先在甘油脱水酶及辅酶维生素B₁₂的作用下脱水生成3-羟基丙醛(3-HPA)，然后3-HPA经醛脱氢酶脱氢生成3-HP，在此过程需要辅酶NAD⁺。同以葡萄糖为底物的路径相比，甘油到3-HP生成途径短，构建和调控更加简单有效。

迄今为止，构建基因工程菌制备3-HP的研究取得了一定的进展，但是还存在诸多问题：⑴途径改造本身需要繁琐的分子生物学操作，后期培养往往还需要额外加入抗生素和诱导剂等，增加操作难度，提高了生产成本；⑵以大肠杆菌为宿主，3-HP产量相对较高，但其自身不具有甘油脱水酶酶活，构建过程复杂，并且大肠杆菌自身不能生成甘油脱水酶的辅酶维生素B₁₂，需要在发酵体系中额外加入，因其价格昂贵，从而使发酵成本大增；⑶代谢过程中会产生各种副产物，分离纯化困难；⑷重组菌中甘油脱水酶和醛脱氢酶的活性平衡问题也影响了3-HP产量的提高；⑸生成3-HP的过程中，醛脱氢酶的辅因子不能及时生成也是制约3-HP产量的重要原因。

(三)发明内容