[发明专利]一种基于GC-MS定量肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用气相色谱-质谱联用仪同时快速定量肠道内容物和粪便样本中11种 短链脂肪酸的检测方法，属于内源性物质检测技术方法。

背景技术

短链脂肪酸主要由饮食中未消化吸收的碳水化合物经肠道菌群发酵产生的一类物质，主 要有乙酸、丙酸和丁酸。在生理状态下，短链脂肪酸能提供肠上皮细胞能量供其代谢，并在 肠粘膜细胞增殖、分化及维持结肠完整性和粘膜免疫应答过程中发挥重要作用。在病理状态， 如肠炎状态下，短链脂肪酸能促进肠粘膜细胞增殖，维持其正常形态，保护肠粘膜机械屏障， 减少促炎因子的生成，降低结肠炎症的发生。且最新研究发现，短链脂肪酸对肿瘤细胞的增殖 能起到抑制作用，并诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，降低癌变的机率。因其在维持机体正常生理 功能中具有重要作用，因此定量检测正常生理状态及病理状态下肠道及粪便中该类物质的含 量具有重要意义。

目前已有许多方法用于定量生物样本中的短链脂肪酸，包括气相色谱、高效液相色谱和 毛细管电泳等方法，其中使用较多的测定方法是采用气相色谱测定，盐酸水溶液酸化、乙醚 萃取，后衍生化样本进行分析，或用乙醚直接萃取样本后FFAP极性柱直接分离样本测定短链 脂肪酸。专利CN105021726A采用蒸馏水直接稀释肠道内容物或粪便，后用GC-FID的检测方 法测定其中短链脂肪酸乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的含量，该方法具有简单、 快速和准确的特点。然而FID检测器相对MS检测器而言，定性需对照品，且准确度及灵敏度 均比MS低，不能给出分子量等信息，因此，采用GC-MS定量肠道内容物或粪便样本中的短链 脂肪酸准确度较高。专利CN104807933A采用酸化乳品，乙醇萃取后用GC-MS对乳品中的短链 脂肪酸进行检测，该方法采用DB-FFAP极性色谱柱对乙醇提取液进行分离，简单灵敏、专属 性强。然而该方法前处理过程中，由于引入酸的作用，所提取的短链脂肪酸可能会与萃取试 剂乙醇反应，导致定量短链脂肪酸结果不准确。

本发明运用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化小鼠肠道内容物和粪便样本，稳定性好的乙 酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用GC-MS定量 小鼠肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸。使用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化样本可 以使萃取液中的含水量较低，保护色谱柱，且能在萃取过程中利于水酯分层。极性较强的乙 酸乙酯的使用可以提高小分子酸如甲酸、乙酸的萃取效率。因乙酸乙酯萃取过程中会溶解少 量水，故本方法进一步对乙酸乙酯进行干燥处理，使得存在于乙酸乙酯中的水分进一步减少。 该方法准确度、精密度高，检测限低，且定量检测短链脂肪酸种类达到11种，能满足小鼠肠 道内容物和粪便样本中主要短链脂肪酸测定的检测要求，有助于分析比较正常和肠炎状态下 短链脂肪酸的代谢处置规律，观察短链脂肪酸的变化能否表征肠炎的动态，为发现肠炎状态 下潜在的生物标志物提供重要依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是优化气相色谱-质谱联用仪定量小鼠肠道内容物和粪便样本 中11种短链脂肪酸的方法，提高短链脂肪酸的提取回收率及提取方法的安全性。该方法准确 度、精密度高，检测限低，且定量检测短链脂肪酸种类达到11种。因肠道内存在的能产生 己酸的己酸菌较少，且己酸在结肠内含量较低，故该方法能满足小鼠肠道内容物和粪便样本 中主要短链脂肪酸测定的检测要求，有助于分析比较正常和肠炎状态下主要短链脂肪酸的代 谢处置规律，为发现肠炎状态下潜在的生物标志物提供重要依据。

本发明的技术方案，一种定量检测小鼠肠道内容物和粪便样本中11种短链脂肪酸的方法， 利用饱和食盐水配制的盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三 氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用气相色谱-质谱联用仪定量检测小鼠肠道内容物和粪便样本中 11种短链脂肪酸，步骤为：