[发明专利]一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因及其表达蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术、生物质利用和食品领域，具体涉及一种高温糖苷水解酶基 因及其表达蛋白与应用。

背景技术：

糖苷水解酶是水解两个糖分子或糖分子与非糖分子之间糖苷键的一类酶。糖苷水 解酶广泛应用于生物和化学产业，如食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域。其 中，纤维素酶由于生物质产业的迫切需求而受到最为广泛的重视。另外，有些糖苷水解酶具 有转糖苷作用，用于合成低聚糖和苷类物质，如一些半乳糖苷酶能利用乳糖合成低聚半乳 糖，有些β-葡萄糖苷酶能利用醇和糖合成烷基糖苷。低聚半乳糖具有保湿性良好、甜度低、 热能低(非消化)、对酸和热稳定等特性，它能促进肠道益生菌(双歧杆菌)的生长，促进脂类 代谢等，有重要保健作用和医用价值，在功能食品领域受到广泛的关注，被广泛应用在保健 品、乳品工业、糖果、饮料等领域。而烷基糖苷是一种重要的化工原料。总体而言，目前糖苷 水解酶存在催化效率低、稳定性不足、应用成本高等问题，限制了相关产业的发展，开发高 效、稳定的糖苷水解酶是生物、化工和食品等产业的迫切需求。极端高温菌长期生活在高温 环境，形成独特的酶体系，其分泌的酶有耐热性强、催化效率高、催化机理独特等特点，高温 糖苷水解酶的开发将加快生物和化工相关产业的发展。本发明提供一种高效多功能高温糖 苷水解酶基因及表达产物。该酶在75℃下水浴12h其酶活仍保持100％，表现出极强的热稳 定性，该酶同时具有β-葡萄糖苷酶、纤维素外切酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶和低聚半乳 糖合成酶活性，其中β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性分别接近和超过文献报道的最高 值。该酶与商业纤维素酶协同水解秸秆，能明显提高葡萄糖和木糖产率；催化低聚半乳糖 (GalOS)合成速率是文献报道的10-15倍，达265.2gL-1h-1，具有潜在的工业应用价值。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是针对现有糖苷水解酶存在热稳定性差、催化效率低、使用成本高 等问题，提供一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因及其表达蛋白与应用，包含高温糖苷水解酶 CoGH1A基因、基因的重组载体和重组工程菌、高温糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列经过一个 或多个氨基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质，以及该糖 苷水解酶的蛋白表达和应用。具体包括如下：

1、一种高温糖苷水解酶CoGH1A的基因，其基因序列如SEQIDNO.1所示。

2、一种高温糖苷水解酶CoGH1A，其氨基酸系列如SEQIDNO.2所示。

3、高温糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列SEQIDNO.2中的氨基酸经过一个或多个氨 基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质。

4、一种用于扩增高温糖苷水解酶CoGH1A基因的方法，其特征在于所使用的引物 为：

PX130015’-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3’

PX130025’-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3’

5、一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因序列的重组载体pET-28b-CoGH1A及其转化而 得的重组工程菌株，所述菌株为大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。

6、本发明提供制备上述高温糖苷水解酶CoGH1A表达和纯化的方法。

7、高温糖苷水解酶CoGH1A在生物质水解中的应用，与商业纤维素酶协同水解，能 同时提高葡萄糖和木糖的得率。

8、高温糖苷水解酶CoGH1A在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的应用。它能迅速分解 牛

奶中的乳糖，利用乳糖合成低聚半乳糖的合成速率是文献报道的10-15倍。

技术方案：

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)高温糖苷水解酶CoGH1A基因重组载体和重组工程菌的构建

提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增高温糖苷水解 酶CoGH1A的基因，再酶切连接到载体pET-28b上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选并通 过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得 还有重组载体的重组工程菌。

(2)上述高温糖苷水解酶CoGH1A的蛋白纯化和酶学活性测定