[发明专利]一种同时检测对虾IMNV、YHV和TSV的多重PCR检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体涉及一种同时检测对虾传染性肌肉坏死 病毒(InfectiousMyonecrosisVirus,IMNV)、黄头病毒(Yellowheadvirus,YHV)、桃拉病 毒(TauraSyndromevirus,TSV)的多重PCR检测引物及试剂盒。

背景技术

世界动物卫生组织(OIE)列出了一些对虾主要病毒性病原，其中对虾传染性肌肉 坏死病毒(InfectiousMyonecrosisVirus,IMNV)、黄头病毒(Yellowheadvirus,YHV)、桃 拉病毒(TauraSyndromevirus,TSV)是对对虾养殖业危害极为严重的甲壳类RNA病毒。 IMNV为双链RNA病毒，无囊膜。发现于南美，2002年巴西发生传染性肌肉坏死病，主要危害南 美白对虾。该病在整个养殖季节可导致对虾累计死亡率为70％。2003年巴西水产养殖业造 成2000万美元的经济损失，至2005年末，对虾传染性肌肉坏死病给巴西水产养殖业造成的 经济损失达到4.4亿美元。至2010年给印度尼西亚造成超过100万美元的损失。2006年该病 毒已被列入亚太地区水生动物监测季度报告(QAAD)的病害监测名录。目前针对IMN还未发 现有效的治疗方法，因此，对该病害主要以防为主，急需建立快速又灵敏的检测方法。

黄头病毒是单股1正链RNA病毒，有囊膜，有3层包膜，有细胞质包涵体。主要感染斑 节对虾(P.monodon)、白滨对虾(Litopenaeussetiferus)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus)、墨吉对虾(Fenneropenaeusmerguiensis)等，其中以斑节对虾最为敏感，斑节 对虾感染后死亡率可达100％，病虾体色发白，头胸部发黄肿大、鳃和肝脏呈淡黄色。淋巴器 官、结缔组织表皮角质坏死，细胞固缩，出现细胞质包涵体。50-70日龄的幼虾最易受感染， 发病后3-5天内死亡率可达100％，给对虾养殖业造成巨大的经济损失。该病毒曾对印度、澳 大利亚、泰国、越南等国家对虾养殖业造成巨大损失。因此为预防及防治TSV的感染，应建立 一种高效的快速、准确、灵敏的检测技术。

桃拉病毒(TauraSyndromeVirus,TSV)是单股正链RNA病毒，二十面体，无囊膜， 有包涵体。是一种给对虾养殖业造成极大危害的病原。该病毒可感染的对虾种类繁多，如： 中国对虾(Fenneropenaeus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(P.monodon)、 细角滨对虾(L.stylirostris)等。其中以凡纳滨对虾最为敏感，主要发生在虾的蜕皮期，感 染率较高，死亡率较大，感染后对虾死亡率为40％-95％。目前对TSV引起的对虾病害尚无有 效的治疗方法，只能以预防为主，因此需依靠早期的快速诊断与筛查方法。

在人工养殖中，对虾可同时感染多种病毒。因此常出现多种病毒混合感染，给对虾 养殖业及海洋资源的可持续发展带来严重威胁。对对虾病原性病毒的检测和监控就显得意 义非常重大。

目前,对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法,分子杂 交及PCR。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种样本，比较费时间。而多重PCR技术 是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病毒特异性引物，能够同时检测多种病 原体，从而缩短病毒检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如 DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病毒引物的特异性、PCR反应条件、不同病毒样本 间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。

基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病毒检测方法，以利于对病毒 的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率 高、且能同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、桃拉病毒的多重PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种同时检测对虾传染性肌肉坏死病毒、黄头病毒、 桃拉病毒的多重PCR引物对，其特征在于，所述引物对分别为IMNV-F和IMNV-R、YHV-F和YHV- R、TSV-F和TSV-R，序列依次如SEQIDNO:1和2，SEQIDNO:3和4，SEQIDNO:5和6所示。