[发明专利]一种过氧化氢酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种过氧化氢酶的制备方法，属于过氧化氢制备技术领域。

背景技术

过氧化氢酶，又称触酶，是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水和氧气，其系统名称是H₂O₂：H₂O₂氧化还原酶，国际酶学委员会的编号为ECl.11.1.6。过氧化氢酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有4个铁原子，其作用基团是血红素。过氧化氢酶主要由四种次单元组成，每一种单元含一种苏木精衍生物称为ProtohemeIX。不管什么来源，它的分子量均是225。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解，防止脱脂过氧化。目前过氧化氢酶主要的应用领域包括：临床、医药及食品加工等领域。

在食品工业中，过氧化氢酶能迅速有效地分解食品加工后残留过氧化氢(双氧水)，适用于在食品加工过程中使用过氧化氢(双氧水)作为漂白剂、氧化剂、淀粉变性剂、防腐剂的食品除氧，可用于纸塑无菌包装材料杀菌后在包装之前的除氧；以及用于消除牛奶、蛋制品、干酪等生产中因紫外线照射产生过氧化氢而造成的特异臭味，是一种用于食品加工的新型除氧酶；产品也可用作烘焙食品的膨松剂；具有保护食品营养物质不被过氧化氢破坏，避免因过氧化氢随食品进入人体内造成对人体伤害的作用。

酶的纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，酶产品还必须保持其生物活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的酶，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯酶的最好方法去纯化酶。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。

目前，国内外主要是从猪、牛等动物肝脏中提取纯化而得，如CN1436846提出了一种由动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，该方法经过将动物肝脏在酸性条件下粗提、高速离心、硫酸铵沉淀、热变性等四个步骤最后得到过氧化氢酶溶液，但是该方法中要用到大量的饱和度45％的硫酸铵，在生产中容易造成大量无机盐的污染，不是环境友好型生产工艺，而且该方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品。

因此，通过改进传统生产工艺，最终得到产物得率高、酶活性稳定，且生产周期短、纯度高的食品级过氧化氢酶产品是很重要的。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法在提取过氧化氢酶的过程中，大多数都是要用到大量的饱和度45％的硫酸铵，使得在生产过程中造成大量的无机盐污染，不仅使得环境二次污染严重，而且得到的过氧化氢酶的活性不高并只能得到酶溶液的现状，提供了一种以豆腐为原料，首先向其中加入氢氧化氢溶液和磷酸混合均匀，随后将混合物中倒入调酒液，并用氮气排出空气，发酵后收集发酵物表面菌丝，之后收集得到的发酵物菌丝放入培养基中，振荡培养，并倒入猪皮表面，再次进行发酵处理，最后将得到的发酵物取出离心后，喷雾干燥，收集干燥物，从而得到过氧化氢酶的制备方法。该方法操作简便，在制备的过程中避免了无机盐的使用，对于环境无任何二次污染，不仅制得的过氧化氢酶的活性高，而且制得的过氧化氢酶为干品，更好稳定，具有更好的缓释作用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

（1）称取2～4kg豆腐放入搅拌机中搅拌成浆状物，再将其放入烧杯，分别向其中加入600～800mL质量分数为30％的氢氧化氢溶液和200～400mLpH为6.5的磷酸缓冲液，搅拌均匀，把烧杯移至微波炉中，频率为80～90Hz，温度为40～50℃，保持温度5～8min；

（2）待上述保温结束后，向烧杯中加入120～140mL调酒液，搅拌均匀后密封烧杯，使用氮气将烧杯中的空气排出，控制温度为35～40℃，以150r/min搅拌发酵4～6天后，停止搅拌静置发酵2～3天，收集发酵物表面的菌丝；

（3）按重量百份比计，取40～45份蛋白膏、10～15份血粉、5～10份琼脂、20～25份质量分数为20％的过氧化氢溶液及10～20份葡萄糖，搅拌均匀，形成培养基，将上述收集的发酵物表面的菌丝放入培养基中，随后将培养基放置于振荡培养箱中，在35～40℃下，以振荡频率200～300rpm，振荡培养2～3天；