[发明专利]采用表面增强显微拉曼光谱检测咽拭标本生化成分的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用表面增强显微拉曼光谱检测咽拭标本生化成分的方法。

背景技术

咽拭子标本就是用医用的棉签，从人体的咽部蘸取少量分泌物，采取的样本就是咽拭子标本，为了检验呼吸道疾病病毒类型，往往通过咽拭子可以方便快捷准确地检测出该病毒类型。目前针对咽拭子标本的检测方法主要有PCR方法、快速抗原方法等，而这些方法虽然各有优点，但操作方法复杂，耗时长、检测灵敏度不高。

拉曼光谱是一种无损的光学检测技术，可以获得丰富的分子结构、振动模式、官能团等指纹信息，对蛋白质、核酸、磷脂和糖分的生化成分变化非常敏感。拉曼光谱具有操作过程简单快捷，灵敏度高，水分子干扰小等优点，是广泛应用于分子结构研究的一种分析方法。但由于拉曼光谱信号非常弱，因此拉曼光谱技术在生化领域的应用受到一定的约束。

表面增强拉曼散射是指在金属胶粒和粗糙金属(如银、金、铜等)表面作用下,试样的拉曼散射强度会增加10⁴～106倍。刘鹏等采用表面增强拉曼光谱技术以对样本检测快速、灵敏、无破坏性等众多优点，在分析生化样本成分方面有着非常重要而广泛的应用。秦维等采用机械粗糙、电化学氧化还原、化学刻蚀等方法对纯钛电极表面进行粗糙，在钛基底上获得了表面增强拉曼光谱信号。陈伟炜等测试分析了白术煎剂及其在银胶中的拉曼光谱，并对其进行初步谱峰归属。表面增强拉曼光谱具有独特的超高灵敏度和分辨率的优越性，对生化成分的分析研究中占据很大的优势。咽拭子仅需要少量的生化物质，对生化物质无损采集，制备成咽拭涂片标本，并结合显微技术和表面增强拉曼光谱，从而实现了对标本的无损显微的生化成分分析。

发明内容

本发明提供了一种采用表面增强显微拉曼光谱检测咽拭标本生化成分的方法，该方法包括表面增强试剂的制备、咽拭标本样品的处理、样品表面增强拉曼光谱的测量，拉曼光谱数据的处理与分析。本方法利用采集的咽拭标本均匀地拖涂在表面平整并洁净无污染的纯铝片上，并滴上制备好的表面增强试剂，在室温下自然晾干，制成咽拭-表面增强拉曼测试片，利用显微拉曼光谱仪的激发光照射咽拭-表面增强拉曼测试片上的咽拭标本，检测在400-1800cm^-1范围的拉曼信号，建立咽拭标本表面增强显微拉曼光谱数据库，经过扣荧光，归一化，取平均值进行处理和分析，获得咽拭标本表面增强拉曼光谱的特征，进行不同咽拭标本的生化成分分析。本发明具有检测时间短，成本低，过程方便快捷等优点，能够获得咽拭样品丰富的生化成分信息，从而为腔内粘膜组织的生化特征和变化提供快速、有效的分析方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

（1）表面增强试剂的制备

采用盐酸羟胺还原硝酸银的方法制备SH银胶，整个制备增强试剂的过程需保持在恒定室温下进行。

1）表面增强试剂的制备：取5mL的浓度为0.06mol/L的盐酸羟胺溶液，加入到4.5mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中；将配制好的混合溶液快速加入90mL浓度为0.0011mol/L的硝酸银溶液中，迅速搅拌至溶液呈均匀的乳灰色，即为SH银胶。在使用银胶时，将SH银胶放入离心机中，设置10000r/min离心十分钟，吸取上层澄清液丢弃，将离心管中下层的银纳米溶胶收集起来备用，即为表面增强试剂；

2）将适量银胶放入离心管里高速离心10分钟，取下层高浓度银胶备用；

（2）咽拭标本样品的处理

将获取的咽拭标本均匀地拖涂在表面平整且光滑洁净无污染的纯铝片上，滴加上上2～3μL表面增强试剂，并使其在室温下自然晾干，制成咽拭-表面增强拉曼测试片。所述的咽拭-拉曼测试片可立即进行测试；或在进行拉曼测试之前存放于-80℃的冰箱或液氮中，在拉曼测试前在室温下自然解冻后进行测试。

（3）样品表面增强拉曼光谱的测量

所述的样品表面增强拉曼光谱的测量指利用显微拉曼光谱仪发出的激光照射在滴加过表面增强试剂的咽拭-表面增强拉曼测试片上的咽式标本，同时收集从该测试片上发出的表面增强拉曼信号光，从而检测在400-1800cm^-1范围的表面增强拉曼信号，而所述检测装置显微拉曼光谱仪记录在上述光谱区的被咽拭标本散射的表面增强拉曼信号，每个咽拭-拉曼测试片采集5-10个不同位置点处的显微表面增强拉曼光谱。

（4）拉曼光谱数据处理与分析