[发明专利]一种用于诱导橡胶树多主棒孢霉真菌产孢方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于诱导橡胶树多主棒孢霉真菌产孢方法，属于生命科学技 术领域。

背景技术：

橡胶树多主树棒孢霉落叶病是继南美叶疫病之后的一种毁灭性病害，能为害 橡胶幼苗、幼树和成龄树，侵害各龄期叶片，造成嫩叶、嫩梢回枯，叶片大量反 复脱落，导致胶乳减产高达20％～25％，甚至造成橡胶树死亡。国内学者在研究 中都遇到该真菌在室内人工培养条件下不易产孢，影响病原菌的形态鉴定及相关 的科研工作。有学者采用室内培养基自然产孢法、纸片产孢法和菌丝打断法等对 橡胶树多主棒孢霉真菌Corynesporacassiicola(BerkCurt)Wei菌株做诱导产孢， 只有极少数橡胶树棒孢霉真菌在培养基上能产孢，用纸片法和菌丝打断法虽然能 产孢，但孢子的形态与自然条件下形成的形态差异较大，难以用于形态鉴定。

发明内容：

本发明目的在于克服现有技术之不足，而提供一种用于诱导橡胶树多主棒孢 霉真菌产孢方法。为后续多主棒孢霉真菌形态鉴定、病原菌入侵方式、致病性和 种群遗传学等相关研究奠定基础。

发明人在研究中发现：在接近自然条件在温室中，采用人工接种活体橡胶树 叶片、诱导其产孢，能够保持多主棒孢霉真菌生长在原来的寄主，而且其生长及 产孢的环境与野生环境相似，所产生的孢子形态与野生条件下形成的一致，且能 用于多主棒孢霉真菌孢子形态观察。

本发明的用于诱导橡胶树多主棒孢霉真菌产孢方法，其具体步骤如下：

(1)接种橡胶苗木准备

选用主栽橡胶树品为嫁接苗，盆栽放置于温室中，常规方法浇水、施肥管理， 当橡胶树新长出叶片处于淡绿色时用于接种多主棒孢霉真菌诱导产孢；

(2)多主棒孢霉真菌培养

将多主棒孢霉真菌接到常规的PDA培养基平板上，置于28℃、自然光照环 境条件下培养7d；

(3)多主棒孢霉真菌接种

用直径为0.5cm的打孔器从28℃、自然光照、常规的PDA培养7d的橡胶 树多主棒孢霉真菌菌落的外圈切取带菌琼脂块，接种到橡胶叶被牙签刺伤部位， 菌丝体直接接触叶片，每片橡胶叶接种一个带菌琼脂块；

(4)诱导产孢

橡胶叶接种后，保持温室内相对湿度保持在80％以上，温度在20℃～30℃， 自然光照条件，3d后除出叶片上接种的带菌琼脂块，待多主棒孢霉真菌侵染橡 胶叶片产生病斑，8d后受害叶部位呈灰褐色时多主棒孢霉真菌在病斑处长出棒 状分生孢子。

本发明的有益效果在于：

1、本方法保持多主棒孢霉真菌生长在原来的寄主，而且其生长及产孢的环 境与野生环境相似，所产生的孢子形态与野生条件下形成的一致，避免了现有室 内人工基质培养导致多主棒孢霉真菌孢子变异。

2、接种环境条件能人工调控不受季节限制、便于操作，节约了人力物力及 时间。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

(1)接种橡胶苗木准备

选用GT1或RRIM600或云研277-5主栽橡胶树品为嫁接苗，盆栽放置于温 室中，按常规方法浇水、施肥管理，当橡胶树新长出叶片处于淡绿色时用于接种 多主棒孢霉真菌。

(2)培养基制备及多主棒孢霉真菌培养

先将土豆洗净去皮，再称取200g土豆切成小块，加水煮沸20min，用8层 纱布过滤，向过滤液中加18g琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g葡 萄糖，搅拌均匀，冷却后再补足水分至1000ml，分装入三角瓶内，盖上硅胶塞、 用4层牛皮纸盖住硅胶塞后再用橡皮筋包扎，121℃灭菌20min后取出三角瓶摇 匀，在超净工作台中将培养基倒入无菌的培养皿中，冷却后挑取多主棒孢霉真菌 的菌丝体接种于培养基中央，将多主棒孢霉真菌放入28℃、自然光照环境条件 下培养7d。

(3)多主棒孢霉真菌接种

接种前用灭菌牙签刺伤的淡绿色橡胶叶片中央待接种的部位。用直径为 0.5cm的打孔器从28℃、自然光照、常规的PDA培养7d的橡胶树多主棒孢霉 真菌菌落的外圈切取带菌琼脂块，接种到橡胶叶被牙签刺伤部位，菌丝体直接接 触叶片，每片橡胶叶接种一个带菌琼脂块。

(4)诱导产孢环境条件

橡胶叶接种后，保持温室内相对湿度保持在80％以上，温度在20℃～30℃ 之间，自然光照条件。3d后除出叶片上接种的带菌琼脂块，待多主棒孢霉真菌 侵染橡胶叶片产生病斑，8天后受害叶部位呈灰褐色时多主棒孢霉真菌在病斑处 长出孢子。取1cm²的感病橡胶叶组织剪成小块放入装有1.0mL水的离心管中、 涡旋振荡，使感病橡胶叶组织上的多主棒状真菌的分生孢子脱落，制成孢子悬浮 液，血球计数板上计数并计算单位面积的产孢量，多主棒状真菌的产孢量达到 0.6×10³个孢子/cm²的感病叶组织。