[发明专利]一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种荷叶总生物碱对植 物病原真菌抑制活性方法及应用。

背景技术

荷叶为睡莲科多年生水生草本植物莲(NelumbonuciferaGaertn) 的叶片，又名莲叶，藕叶。我国荷叶资源丰富，以长江、黄河和珠江 等三大流域分布最广。传统医学认为，荷叶味苦、平，归肝、脾、胃 经，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的活性。据《本 草纲目》记载“荷叶服之，令人瘦劣”、“生发元气，稗助脾胃，涩 精浊，散淤血，消肿痛，发痘疮”。在2003年3月中华人民共和国 卫生部的卫监发(2002)第51号文件中，荷叶被列入第2批“既是食 品又是药品”的名单之中。目前，荷叶的临床应用较多的是以复方的 形式用于减肥降脂。此外，荷叶金银花口香糖通过在口香糖配料中加 入适量对口腔有保健作用的荷叶抑菌成分，以增加口香糖的保健功能。 荷叶化学成分复杂，除含有植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质、 无机盐和水等成分外，还含有生物碱、黄酮等多种生物活性成分。干 荷叶中总生物碱含量约为1.0％，主要为异喹啉类和阿朴啡类，并多 以去氢和甲基化两种形态存在。研究发现，荷叶中生物碱类物质能干 扰微生物蛋白质的代谢，抑制纺锤体微管蛋白聚合，同时还能抑制 RNA聚合酶的活力，中断细胞膜脂质的合成和氨基酸在细胞膜上的 转运，使微生物的有丝分裂停止于中期，因此具有良好的抗菌作用。 如荷叶总生物碱具有明显抑制细菌生长的作用，其单体鹅掌楸碱对大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为32μg/mL，杏 黄罂粟碱对红色毛癣菌和石膏状小孢子菌的MIC均为16μg/mL，O- 去甲基荷叶碱对金黄色葡萄球菌的抑制作用与氯霉素相当。在农作物 侵染性病害中，主要有真菌性病害和细菌性病害两种，其中真菌性病 害约占病害的70～80％。一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病 害。目前主要采取农药喷施方法对其进行防治。由于大量农药的使用 对环境和人畜造成了深远而惨重的危害。因此，充分挖掘尚未得到合 理利用的资源，从植物中发现开发高效低毒的天然有效抗菌活性成分 成为一条重要途径，符合绿色思维的发展潮流。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制 活性方法及应用，旨在解决目前主要采取农药喷施方法对植物病原真 菌进行防治，大量农药的使用对环境和人畜造成了深远而惨重危害的 问题。

本发明是这样实现的，一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活 性方法，所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括：

孢子悬液的制备：将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面 活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水 倒入试管中，用无菌的玻棒在斜面上搅动，将孢子刮下来，并用两层 纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长 浊度，将孢子悬液稀释；

经微波辅助热回流法提取、D－101型大孔吸附树脂纯化、冷 冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％，取荷叶总生物碱固体适量， 溶解，配置总生物碱溶液，调节pH，将溶液用微量小滤器过滤除菌 后用于体外抑菌试验；

采用管碟法。待培养基冷却到50℃时，加入2mL孢子悬液，摇 匀，倒入直径为12cm培养皿中，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层 上，每杯加入荷叶总生物碱，观察抑菌圈的大小；

采用试管倍比稀释法，分别用50％乙醇溶液置备荷叶总生物碱， 分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中， 再加入0.2mL孢子悬液，30℃培养48h，从试管中吸取0.2mL的培养 液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温培养箱中， 培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀 菌浓度；

采用平皿倍比稀释法，培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基 还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、 2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL 荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照，待培养凝 固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养 48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的最低抑菌 浓度。