[发明专利]一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种苹果褪 绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法。

背景技术

苹果属蔷微科苹果属，多年生落叶果树，原产于亚洲中部、欧洲 东南及新疆西部。苹果病毒是导致苹果果树传染病的主要因素，大多 通过嫁接、修剪等传染。若病毒在植株体内长年积累，将会引发严重 后果。由于病毒是专性寄生，当其大量繁殖时，会干扰果树正常繁殖 代谢，引起树体长势减弱、叶片萎缩翻卷和果实畸形、风味变劣，果 树提早枯死，甚至绝产，严重影响苹果的产量。因此，早期对苹果果 树进行病毒检测以及时采取防控措施，已迫在眉睫。

苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)是果 树传染病的最主要病原体之一，又名苹果潜隐病毒1，属于纤毛病毒 属(Trichovirus)，主要侵染苹果、梨、核果类果树及蔷藻科观赏品 种等。被苹果褪绿叶斑病毒侵染的果树植株，树体长势日趋衰退，叶 片上会出现褪绿色如黄色斑点或条状斑，卷缩变小或向对侧弯曲，严 重影响叶片的光合作用面积。

苹果褪绿叶斑病毒是一种正义单链RNA病毒，为弯曲柔软的纤 维状条形，无鞘膜，其碱基长度约为7.5kb，核酸分子量大概是 2500kDa，外壳蛋白由多肽组装而成，分子量约为22kDa。目前对苹 果褪绿叶斑病毒的检测，多采用传统的肉眼观察、血清学法以及分子 生物学检测方法，如RT-PCR。然而，传统方法耗时长，灵敏度不高， 特异性差，对检测人员的水平要求相对较高；血清学方法费用昂贵， 操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体发生非特异性反应 的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛；而常规RT-PCR的 特异性和灵敏度也不高。为了适应产业发展需求，有必要开发一种能 够更加快速、准确地对苹果褪绿叶斑病毒进行检测的方法。

环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献 NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,Amino N,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.Nucleic AcidsRes.2000Jun15；28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需 模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实 现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性强、 灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。

逆转录-环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的 RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增 原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆 转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检 测方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种苹果 褪绿叶斑病毒检测试剂盒，其特征在于包括4条特异性引物：外引物 F3，其序列如SEQIDNO:1所示；外引物B3，其序列如SEQIDNO:2 所示；内引物FIP，其序列如SEQIDNO:3所示；内引物BIP，其序 列如SEQIDNO:4所示。引物序列具体如下：

外引物F3：ATGGAGGATCAGAAAGTGAT(SEQIDNO:1)

外引物B3：TGGTTGTAAAGAGGTTTGTGA(SEQIDNO:2)

内引物FIP：TGGGTCCGAAGATGTAGTCTTGA-GTCATACA ATCTGAAGGAGGT(SEQIDNO:3)

内引物BIP：TCAGCAACATGACTTTCCGTCAG-CCTTTATAC TTCAATTTCACCAAC(SEQIDNO:4)。

优选所述外引物F3和B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP 和BIP的浓度均为40pmol/μl。