[发明专利]一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，属于农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留残留检测技术领域。

背景技术

农作物是我国重要的经济作物，在我国大多数地区都有种植，农作物在生产过程中，易受到病原物的为害，在气候条件适宜的前提下，常发生严重的病害，从而给农作物生产带来巨大的经济损失。农作物白粉病、赤星病、萎蔫病、白绢病、蛙眼病等是常见的农作物真菌病害，在实际生产中，常使用多菌灵和甲基硫菌灵对上述病害进行控制和治疗。

多菌灵和甲基硫菌灵同属于苯并咪唑类，是具有保护、治疗、内吸作用的杀菌剂，具有高效、广谱、低毒的特点，甲基硫菌灵在植物体内转化为多菌灵，作用机理均为干扰菌的有丝分裂中纺锤体的形成，影响细胞分裂。由于多菌灵和甲基硫菌灵对健康具有潜在威胁，所以各国对上述物质的残留限量制定了严格的标准，甲基硫菌灵和多菌灵统一以多菌灵来计，我国规定农作物中多菌灵的残留限量为2mg/kg。

从现有技术和相关检测标准看，目前针对多菌灵和甲基硫菌灵残留的最常用的检测方法是HPLC，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用。因此，寻求更为快速的检测手段，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸及其应用、制备方法，具有操作简单、灵敏度高、成本低、检测时间短，以及可同时检测多菌灵和甲基硫菌灵残留等优点，可以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种可同时检测农作物中多菌灵和甲基硫菌灵残留的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫包被有多菌灵单克隆-胶体金标记物。

所述多菌灵偶联抗原是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述多菌灵单克隆-胶体金标记物是将多菌灵单克隆抗体加入胶体金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。

所述多菌灵单克隆抗体是用多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。

所述多菌灵半抗原是由多菌灵与马来酸酐反应得到，其分子结构式为：

。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，其中所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。

本发明还提供一种制备上述试纸的方法，其包括以下步骤：

1）制备包被有多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有多菌灵偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成所述试纸。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：称取0.5g-2g多菌灵溶于经干燥后的四氢呋喃中，通氮气保护，加入0.24-1g马来酸酐常温搅拌溶解，加入10-50mg DMAP体进行催化反应，70℃回流反应，用TLC薄层板监测反应进行，直至没有原料或原料点很浅，停止反应，硅胶柱净化，浓缩得多菌灵半抗原产物；

2）将多菌灵半抗原与载体蛋白偶联，得到多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到多菌灵单克隆抗体；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的多菌灵单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将多菌灵单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥环境中保存备用；

8）多菌灵半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线（T线），并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；