[发明专利]一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法，属于三唑酮检测技术领域。

背景技术

三唑酮(Triadimefon)，1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-α-丁酮，是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的三唑类杀菌剂。被植物的各部分吸收后，能在植物体内传导，对锈病和白粉病具有预防、铲除、治疗、熏蒸等作用。在实际生产上三唑酮用途广泛，常被用来治疗农作物白粉病和其他真菌病害。

由于三唑酮对人体有害，因此各国对三唑酮的残留限量制定了严格的标准。例如烟草中制定了中三唑酮最高残留限量为5mg/kg。

从现有技术和相关检测标准看，目前针对三唑酮残留的检测方法主要是仪器方法，最常用的方法是GC-MS，仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员，所以限制了其应用。因此，寻求成本低廉、更为快速的检测手段，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种检测农作物中三唑酮残留的试纸及其应用、制备方法，具有操作简便、灵敏度高、成本低、制作方便，检测时间短等优点，可以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种检测农作物中三唑酮残留的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有三唑酮偶联抗原的检测线（T线）和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（C线），所述结合物释放垫包被有三唑酮单克隆-胶体金标记物。

所述三唑酮偶联抗原是由三唑酮半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

所述三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物是将三唑酮单克隆抗体加入胶体金中得到，其中所述胶体金是由柠檬酸三钠与氯金酸反应制取得到。

所述三唑酮单克隆抗体是用三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，然后将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到。

所述三唑酮半抗原是由三唑酮与盐酸羟胺在固体氢氧化钾作催化剂存在下回流得肟产物，肟产物再与马来酸酐反应得到，其分子结构式为：

。

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，其中所述结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。

本发明还提供一种制备上述试纸的方法，其包括以下步骤：

1）制备包被有三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2）制备具有包被有三唑酮偶联抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：三唑酮与盐酸羟胺在固体氢氧化钾作催化剂存在下回流得肟产物，肟产物与马来酸酐在吡啶或三乙胺催化下进行反应，获得半抗原；

2）将三唑酮半抗原与载体蛋白偶联，得到三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物，即三唑酮偶联抗原；

3）用三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到三唑酮单克隆抗体；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6）将步骤3）制备的三唑酮单克隆抗体加入步骤5）制备的胶体金中，得到三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物；

7）将三唑酮单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，37℃烘60min后取出，密封并置于干燥环境中保存备用；

8）三唑酮半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线（T线），并将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线（C线）；

9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积百分含量）、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，密封包装，4-30℃条件下可保存12个月。

本发明另外还提供一种应用上述试纸检测农作物中三唑酮残留的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试纸进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明的有益效果是：