[发明专利]单管中多重靶核酸的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒在审

专利信息
申请号: 201610129787.0 申请日: 2016-03-08
公开(公告)号: CN105624311A 公开(公告)日: 2016-06-01
发明(设计)人: 戴立忠;龚小鹏;邓中平;罗惠宾;文荻琛 申请(专利权)人: 湖南圣湘生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 北京弘权知识产权代理事务所(普通合伙) 11363 代理人: 逯长明;许伟群
地址: 410600 湖南省长*** 国省代码: 湖南;43
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摘要:
搜索关键词: 单管中 多重 核酸 实时 荧光 pcr 检测 方法 及其 试剂盒
【说明书】:

技术领域

发明属于核酸检测技术领域,涉及在单个PCR反应容器中多重检测样品中靶核 酸的PCR方法,具体涉及一种单管中多重靶核酸的实时荧光检测PCR方法以及检测试剂盒。

背景技术

自1971年开始HBsAg作为常规筛查项目引入到血液筛查,使得输血后感染乙肝的 发生率大大降低,但每年仍有少量新发输血后肝炎病例报道。例如美国无偿献血者每单位 供血传播HBV的危险性为1/6.3万。这些危险主要来自HBV“窗口期”、病毒变异、低病毒载量 感染等。间接酶联免疫法(ELISA)筛查并不能从根本上排除病毒存在的危险,由于HBV感染 后病毒颗粒先于HBsAg释放到血液中,在约50天的“窗口期”内,感染者的HBsAg检测呈阴性, 但是其血液却具传染性。而使用核酸检测(Nucleicacidtest,NAT)技术能提前20天筛查 出HBsAg阴性、HBV-DNA阳性献血者。

随着血液制品在世界范围的流通,HCV感染呈世界性分布,为了控制丙型肝炎病毒 的血液传播,世界各国均开展了对献血员抗-HCV的检测。常用的抗-HCV诊断试剂采用间接 酶联免疫法(ELISA),第一代抗-HCVELISA采用的抗原C100-3是HCV非结构基因(NS3/NS4) 和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白,灵敏度低,漏检率较高;第二代抗-HCV ELISA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c,虽然在灵敏度和 特异性上有很大改善,但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏 检。目前我国多采用第三代抗-HCVELISA试剂,其包被抗原为HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5 抗原,特异性超过99%,虽然目前缺乏判断其敏感性的金标准,但对于免疫功能正常的HCV- RNA阳性感染者,抗-HCV检出率也高于99%。HCV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口 期,平均为70天,有的患者窗口期可延长至6-9月或更长,约1%-3%的患者抗-HCV可持续阴 性,而基因组的复制出现得很早,感染后数天即出现病毒血症。已有输血后即有丙型肝炎病 毒感染发生的报道,这表明抗-HCV阴性的献血员中有少数存在丙型肝炎病毒输血传播的可 能性。

人类获得性免疫缺陷综合症简称艾滋病,是由一种存在于血液中并攻击免疫系统 的病毒引起的。据WHO估计,我国艾滋病感染人数到2010年将达到1000万,并持续高速增长。 血液传播是艾滋病毒传播的重要途径之一。全球每年增加560万艾滋病毒携带者,有5%至 10%的人是经过输血或血液制品而感染的。

根据所采用的检测方法的灵敏度不同,感染窗口期的长短不同。采用核酸测定方 法,HIV的感染窗口期为11天;采用第3代EIA试剂盒,HIV的感染窗口期为22天;采用第4代 EIA试剂盒,HIV的感染窗口期为18天。由于空白窗口期的存在,即使未来技术的灵敏度足以 消除感染窗口期,仍然无法将HIV感染的窗口期缩短为零。

目前,在临床上筛选各种血源性传播疾病的方法,主要是免疫学诊断方法。尽管随 着第三代单克隆诊断抗体的出现,在很大程度上增加了筛查和检测的灵敏度,并在一定程 度上减少了血源传播病毒性疾病的概率。但由于受免疫学诊断方法的灵敏度及其与生俱来 的限制,依然不能完全杜绝阳性病毒血样的漏检,漏检率较高。其主要原因在于,免疫学诊 断主要依赖抗原抗体介导的免疫反应,而病毒感染机体后,机体产生可检测水平的高滴度 抗体的需要一段相对较长的时间。另外,由于个体免疫机能不同,其中有少数感染者感染后 机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线一下,甚至不产生抗体。因此,免疫学诊断 方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员,这样势必导致漏检。其次,抗原出现 变异以及稀有亚型也可导致漏检,因此,免疫学筛查后,输血相关疾病传播依然存在一定的 概率。

目前免疫学检测以上三种病毒的平均窗口期分别为:HBV56天,HCV70天,HIV22天。 近5年来,随着以核酸检测(Nucleicacidtest,NAT)为代表的分子生物学技术在血液筛查 方面的应用,输血及血制品安全性有了很大的提高。在理论上,NAT技术能够显著的缩短病 原体检出的窗口期。另外,NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测 HBV,HCV,HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前:9天、25天、14天。而应用NAT技术筛查献血 员,相应的可将献血员传播以上病毒性疾病的概率分别降低42%、72%和50%。

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