[发明专利]一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法有效
| 申请号： | 201610129861.9 | 申请日： | 2016-03-08 |
| 公开（公告）号： | CN105624312B | 公开（公告）日： | 2018-10-23 |
| 发明（设计）人： | 娄兵海;宋雅琴;邓崇岭 | 申请（专利权）人： | 广西特色作物研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844;C12Q1/04;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 | 代理人： | 杨立 |
| 地址： | 541004 广西壮*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 柑橘 黄龙 病菌 亚洲 聚合 链式 置换反应 检测 方法 | ||
1.一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)柑橘植株叶片中脉组织的DNA提取：从柑橘植株叶片中脉组织提取DNA，获得DNA模板；
(2)设计并合成引物，引物序列为：
上游引物：5'-TGTCCATATGATCTTCGATAATGCGAG-3'，
下游引物：5'-AGGGTGGATTAGATCGTTTTCTCTCAA-3'；
(3)聚合酶链式置换反应：
①构建聚合酶链式置换反应体系：10×SD Polymerase React ion Buffer2μL、100mmol/L MgCl20.6μL、2.5mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L上、下游引物各2μL、10U/μL SD酶0.4μL、100ng/μL DNA模板1μL，ddH2O9μL；
②聚合酶链式置换反应程序：92℃，预变性2min；92℃，变性30s；62℃，退火/延伸2min；35个循环；62℃，延伸10min；
(4)结果判断：
取5μL扩增产物进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪观察并保存电泳结果，在234bp和261bp处各出现一条特异性扩增条带或只在234bp处出现一条特异性扩增条带的为柑橘黄龙病菌亚洲种阳性样品，不出现扩增条带的为柑橘黄龙病菌亚洲种阴性样品。
2.根据权利要求1所述的一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其特征在于，步骤(3)所述DNA模板包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上斑驳型黄化叶片中脉组织提取的DNA，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片中脉组织提取的DNA。
3.根据权利要求1所述的一种柑橘黄龙病菌亚洲种聚合酶链式置换反应检测方法，其特征在于，步骤(3)所述质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶含1×4S Green Plus无毒核酸染料。
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