[发明专利]抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf‑91鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽thanatin蛋白与orf‑91鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接。该融合蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、orf‑91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽thanatin蛋白编码基因与orf‑91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白，大小为21KD。抗菌活性研究表明产物该蛋白具有抗菌活性，构建体系解决了天然抗菌肽表达量低、对宿主伤害大、难以通过基因工程手段获得的难题，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体在受到病原微生物侵袭时自身诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫的主要成分，一般由20-60个氨基酸残基组成。很多抗菌肽不仅能在较低浓度下有效抑制细菌、病毒、真菌和原虫等多种病原微生物的生长，甚至还可以杀死肿瘤细胞，而对正常的没有发生病变的真核细胞几乎没有作用。自从天蚕素被发现以来，人们相继从生物界分离到1700多种抗菌肽，它们的分布极其广泛，从哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类到植物、细菌和病毒等均有发现，其中以昆虫抗菌肽种类最多。

死亡素(thanatin)又称死亡肽，是由斑腹刺益蜷(Podisus maculiveniris)诱导产生的一种环状昆虫抗菌肽，由21个氨基酸残基组成，其中第8-21位氨基酸残基形成β反向折叠结构，此结构由11位和18位两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键来稳定。死亡素结构简单，抗菌谱相对广，对G⁺和G^-细菌、某些真菌及原虫都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性，是迄今已知所有昆虫抗菌肽中抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，其最小抑杀浓度(MIC)约为0.25-4ug/ml。

但目前，抗菌肽大多都是单独存在而发挥其抗菌功能，对不同菌株的杀菌能力还是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术，提供一种抗菌肽融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系蛋白表达量大，利于纯化复性和保持活性，适用于工业化大生产，且更为重要的是，该融合蛋白抗菌活性高，其本身和编码基因可应用于抗菌药物制备中，能为抗菌药物制备提供新的良好的材料来源。

本发明所采用的技术方案为：

一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf_91鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽thanatin蛋白与orf_91鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽thanatin蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述orf_91鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQID NO.9所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQ ID NO.10所示。即该蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、orf_91鲨肝肽蛋白，或orf_91鲨肝肽蛋白、3GSA柔性肽、抗菌肽thanatin蛋白。

该蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、orf_91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽thanatin蛋白编码基因与orf_91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。所述抗菌肽融合蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO.4所示或如SEQ ID NO.5所示。

上述抗菌肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽thanatin蛋白编码基因序列、3GSA柔性肽编码基因序列、orf_91鲨肝肽编码基因的tha-orf_91融合基因序列和/或orf_91-tha融合基因序列，分别如SEQ ID NO.4所示、如SEQ ID NO.5所示；