[发明专利]一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：(1)根据合浦珠母贝肉抗氧化肽的氨基酸序列，构建出其目的基因，经双酶切后，与同样经双酶切的原核表达质粒PGEX‑6P‑1相连接，制得原核重组表达载体，将原核重组表达载体经热激转化至大肠杆菌感受态细胞，制得重组工程菌株；(2)将重组工程菌株培养，并添加IPTG诱导培养后，离心收集菌体，将菌体超声破碎后收集沉淀，获得含有目的蛋白的沉淀；(3)利用GST琼脂糖亲和层析分离纯化，即得到合浦珠母贝肉抗氧化肽。该方法高效、专一性强、成本低，获得的合浦珠母贝肉抗氧化肽纯度高，抗氧化活性强。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法。

背景技术

海洋生物体内具有许多天然的蛋白质类抗氧化活性物质，我国海域面积广阔，横跨热带、亚热带、温带三个气候带，海洋物种丰富，为科研工作者提供了一个天然海洋活性大分子有机物库源，可以发现更多高效、专一的大分子或小分子抗氧化活性物质，进而更好地应用于实际生产来改善人民膳食营养结构、提高人民的健康生活水平。深入开发利用海洋生物资源不仅能满足和保障国内食品供给和一些低值鱼贝类的高值化利用，而且能带来更多的就业机会，促使相关产业更快地转型升级，并且对维护国家海洋权益、建设海洋强国也具有一定的积极意义。

合浦珠母贝又称马氏珠母贝，是我国海水养殖生产“南珠”的母贝，属软体动物门瓣鳃纲珍珠贝目珍珠贝科珠母贝属，主要分布在广西、广东、海南和台湾海峡南部沿海、日本沿海一带；合浦珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪、低糖、营养价值高的优质蛋白来源的海产品。其粗蛋白干重含量在66.71％～81.2％之间，具有较高的开发利用价值。

中国水产科学研究院南海水产研究所近10年来一直致力于合浦珠母贝肉的开发利用，从一开始的粗酶解液功能饮料到如今的抗氧化肽纯品功能性质的探索，积累了一系列的成果。但是，合浦珠母贝肉抗氧化肽在食品、医药及化妆品领域的应用则由于研发时间短、上游珍珠养殖业转型升级慢、产业链自动化程度低、化学合成安全问题、贝肉提取纯化率低、工艺成本高等原因导致其应用仍处于初级实验室理论研究阶段。所以还需进一步结合现代生物学技术提高制备抗氧化肽速度和纯度、明确其构效关系、降低工艺成本，并利用基因工程，对明确后合浦珠母贝源抗氧化肽序列结构进行原核或真核表达，从而实现大规模制备生产合浦珠母贝源抗氧化肽，最终转化应用到食品、医药、化妆品等领域。

近期研究发现，通过对珠母贝肉进行定向酶解，可以得到小分子抗氧化活性肽，经质谱结构解析得到相对应的氨基酸序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg；与之对应的氨基酸序列简写为GAGLPGKRER(具体参阅申请号为201410040473.4的发明专利中所述)；该肽抗氧化活性强，且较稳定，为了将这个抗氧化肽大量生产应用，如果只是采用酶解珍珠贝肉的方法，由于酶解过程副反应较多，含有多种其他肽类和小分子物质，纯化成本较高，产量又低。因此，急需寻找一种专一性强、成本低的方法来生产这种序列的合浦珠母贝肉抗氧化肽(PFMAP，Pinctada fucata meat antioxidant peptides)。

因此，本发明拟以中国水产科学院南海水产研究所前期分离得到的一段小分子抗氧化肽(Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg)为基础，通过大肠杆菌(E.coli)原核表达来制备合浦珠母贝肉抗氧化肽，这与传统酶解方法制备相比在制备抗氧化肽纯品纯度、制备速度、成本、自动化程度方面将具有无可比拟的优势！

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组合浦珠母贝肉抗氧化肽融合基因原核表达的方法，该方法高效、专一性强、成本低，获得的重组合浦珠母贝肉抗氧化肽融合基因纯度高，抗氧化活性强。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：