[发明专利]一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法

说明书

一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法，步骤有：取继代培养无菌组培苗，留基部放入不含激素MS培养基内培养，切离基部新萌植株，转入含0.3molL^‑1蔗糖和脱落酸0.5‑5mgL^‑1培养基上培养，再转入0.7molL^‑1和含脱落酸0.5‑5mgL^‑1培养基上预培养，剥取茎尖，在0.4 molL^‑1蔗糖和甘油2moL^‑1MS固体培养基预培养，在2‑4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，放在装载条上，再浸入含有0.1‑0.3%氯化钙、0.4 molL^‑1蔗糖和2moL^‑1甘油MS液体培养基中，经固定后，吸去多余液体，置于预处理溶液中处理，再转入玻璃化保护剂PVS2中进行冰浴处理，然后投入液氮中保存。其有益效果是，保存方法简便易行，稳定可靠，保存后野生稻恢复生长状况良好。

技术领域

本发明涉及一种野生稻茎尖的保存方法，具体的说，涉及一种普通野生稻茎尖的超低温保存方法。同时，本发明还涉及到野生稻茎尖的超低温保存后的恢复培养方法，属于植物细胞工程技术领域。

背景技术

野生稻资源是稻种资源的重要组成部份, 它保存了栽培水稻没有或已经消失了的基因, 并具有特殊的优良性状及高抗病虫害的特性，其有利基因的发掘和保存，对提高水稻产量和品质具有不可估量的价值。当前迅速恶化的环境和不利的气候条件正在侵蚀着水稻的遗传多样性；人类现代急速扩张的经济活动，导致了野生稻生境丧失及恶化、栖息地急剧减少；此外野生稻又具有柱头外露、异交结实率较高、种子落粒性强的生物学特性。这些因素使野生稻种面临灭绝的危险, 对野生稻遗传多样性的保护刻不容缓。目前，对野生稻的保护措施主要有就地保护和迁地保护，即以种子保存的种质厍、以种茎保存的种质圃。

植物组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟了新的途径，组织培养物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遗传特性。而超低温保存（-196℃）下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。

关于植物超低温保存的研究，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物为主的植物遗传资源的超低温保存。水稻的超低温保存自1979年Sala等首先报道水稻悬浮细胞的超低温保存后，相关研究多集中在组织培养物如悬浮细胞系、愈伤组织、原生质体及胚状体上，关于水稻完整器官（如茎尖）冻存的报道仅见章志宏教授等在2000年采用程序降温法对水稻单倍体幼穗离体培养诱导的不定芽进行超低温保存，得到再生植株。野生稻的超低温保存技术相关报道更少且集中于国内，如殷晓辉教授等1996年在普通野生稻、宽叶野生稻以及瘤粒野生稻愈伤组织超低温保存研究中首次获得了冻后再生植株，实验证明了野生稻幼穗离体培养物的超低温保存是稻属资源保存的有效途径。谭光轩教授等采用程序降温法对野生稻幼穗离体培养诱导植株，直接进行超低温保存，避开愈伤组织阶段减少遗传变异的危险，但产生的绿芽一周后白化死亡。

野生稻完整器官的冻存，将是今后研究的重点，但由于野生稻茎尖分生组织体积小、由于野生稻的茎尖组织具有细小、幼嫩的特点，生理状态脆弱，且被外部护叶层层紧密包裹，在茎尖剥取、预培养及玻璃化冻存操作中容易折断及受到伤害，保存中难以成活。同时，在其后的恢复培养中也不易再生或产生白化苗。采用程序降温的冷冻方法对设备要求较高。

发明内容

由于现有技术中存在野生稻茎尖分生组织体积小、生理状态脆弱，保存中难以成活的现象。本发明的目的是提供一种野生稻茎尖的超低温保存方法，同时还提供一种野生稻茎尖超低温保存方法后解冻恢复培养方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种野生稻茎尖的超低温保存方法，包括如下步骤：