[发明专利]一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，属于生物技术领域。所述PCR反应体系中有一对特异性引物Api‑F和Api‑R，上述引物能够从感染熊蜂孢子虫的熊蜂DNA中特异性扩增一段316 bp的片段，从而实现对熊蜂孢子虫的PCR检测。本发明的熊蜂孢子虫PCR检测方法，对全基因合成的熊蜂孢子虫DNA的检测灵敏度可达到1.39 fg/μL，具有特异性强，稳定性好，快速准确的特点，可用于进境熊蜂和国内养殖熊蜂体内熊蜂孢子虫的检测，为防止熊蜂孢子虫的传入和国内熊蜂孢子虫病的防控提供可靠的理论和技术依据。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法。

背景技术

熊蜂孢子虫（Apicystis bombi）属于类锥体纲（Conoidasida）、簇虫亚纲（Gregarinasina）、新簇虫目（Neogregarinorida）、孢子虫属（Apicystis）。熊蜂孢子虫是一种寄生于熊蜂属和西方蜜蜂的原生动物寄生虫，外形与熊蜂微孢子虫类似但较大，孢子呈船型，大小约11.4-14.4 μm长，3.6-5.4 μm宽。自在芬兰和意大利出现后，这种寄生虫很快传染到欧洲各国，目前国内尚没有熊蜂孢子虫的报道，但这种寄生虫致病力强，如不严格预防，随着商用熊蜂群进出口贸易往来的加大，将对我国熊蜂的饲养和繁育产生巨大影响。

熊蜂孢子虫的检验主要是解剖观察和镜检观察，镜检观察主要是取病蜂的脂肪体和中肠组织涂片在甲醇中固定2分钟，0.25%吉姆萨染色8—12小时后，于光学显微镜下观察。镜检观察容易漏检，且易与微孢子虫病、短膜虫病等混淆。

发明内容

本发明的目的在于提供一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，以便准确、灵敏、快速、经济地检测进口熊蜂及国内养殖熊蜂蜂群中的熊蜂孢子虫。

本发明提供的熊蜂孢子虫的PCR检测方法，具体步骤如下：

利用特异性引物对，对疑似感染熊蜂孢子虫的熊蜂腹部组织DNA进行PCR 扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出316 bp的熊蜂孢子虫基因片段，则标志着待检测样品为熊蜂孢子虫阳性。

其中，所述特异性引物对为：

上游引物Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；

下游引物Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。

其中，所述PCR的反应体系如下：

反应体系总体积为20 μL。

其中，所述PCR 的反应条件为：95℃预变性4 min 后进入循环，95℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，40个循环，最后72℃延伸10 min。

其中，所述凝胶电泳为1.5％琼脂糖凝胶电泳。

本发明还提供用于熊蜂孢子虫的PCR检测方法的特异性引物对，上游引物为上游引物 Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；下游引物为Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。

本发明还提供所述熊蜂孢子虫的PCR检测方法在进境熊蜂及国内养殖蜂群中的应用。