[发明专利]一种蜂巢小甲虫的PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种蜂巢小甲虫的PCR检测方法，属于生物技术领域，所述PCR反应体系中有一对特异性引物Aet‑F和Aet‑R，上述引物能够从蜂巢小甲虫线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ基因序列（GenBank ID：AF522358）中特异性扩增一段205 bp的片段，从而实现对蜂巢小甲虫的PCR检测。本发明的蜂巢小甲虫PCR检测方法，对全基因合成的蜂巢小甲虫DNA的检测灵敏度为0.77fg/μL，具有特异性强，稳定性好，快速准确的特点，可用于进境蜂类病虫害检测，为防止蜂巢小甲虫的生物入侵提供可靠的理论和技术依据。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种蜂巢小甲虫的PCR检测方法。

背景技术

蜂巢小甲虫（Aethina tumida）属于鞘翅目(Coleoptera)露尾甲科(Nitidulidae)，是蜜蜂的六大重要病原体之一。蜂巢小甲虫有四个发育时期，卵主要产在蜂箱内护脾工蜂不多的幼虫脾和粉蜜脾以及巢脾缝隙间，和蜜蜂卵相似但稍小；幼虫为乳白色，以蜂蜜和花粉为食，取食后巢房和封盖被其破坏，蜂蜜呈水态发酵，甚至起泡溢出巢房，散发异味。有时幼虫会产生带臭味的粘液，可迫使蜂群飞逃；成熟的幼虫离开蜂巢进入土壤化蛹，由白色逐渐变为棕色，羽化后的成虫由棕色变成褐色或黑色，飞行能力很强，主要以粉蜜和蜜蜂的卵及幼虫为食，可有效引起蜜蜂蜂群的大规模损失。

蜂巢小甲虫最早起源于南非，1998年确认传入美国，随后传播到埃及、加拿大和澳大利亚等国。蜂巢小甲虫传播途径极其广泛，虽然蜜蜂是其主要寄主，但小甲虫成虫可以在没有食物和水的情况下存活5天，因此它还可以通过转移的蜂群、蜂箱、蜂胶、蜂蜡和运输工具，以及进出口的养蜂设备甚至附着的土壤等传播，蜂巢小甲虫是兼性寄生虫，可以在水果中繁殖，因此它还可以通过果蔬产品的流通而传播。随着熊蜂、蜜蜂等进出口贸易的日益增多，由此带来的生物入侵等安全风险日益受到关注，因此，建立一种快速准确的检测方法对于防止蜂巢小甲虫的入侵具有重要意义。

蜂巢小甲虫的检测方法主要是解剖镜下观察其幼虫，其外形虽和其他巢虫类似，但其背部有荆状突刺，其明确的头壳和发育完全的胸足以及产生黏液的特点，因此可与其他巢虫区分开来，此外小甲虫的卵太小不易观测，易与熊蜂及蜜蜂卵混淆，蛹则易与大蜡螟蛹相混淆，成虫在外形上也与其他甲虫极为相似，难以检出。PCR检测方法可迅速检出各个发育时期的小甲虫，甚至可以对蜂巢碎片及土壤等进行检测，杜绝其携带虫卵等，可广泛应用于进境样品的检测。本发明在全基因合成的蜂巢小甲虫线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ基因的基础上，通过特异性引物的设计，建立了一种蜂巢小甲虫的PCR检测方法。

发明内容

本发明的主要内容是提供一种蜂巢小甲虫的PCR检测方法，以便准确、灵敏、快速地检测进出口蜂群中的蜂巢小甲虫。

本发明提供的蜂巢小甲虫的PCR检测方法，具体步骤如下：

利用特异性引物对，对待检测的疑似蜂巢小甲虫的DNA进行PCR 扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出205 bp的蜂巢小甲虫COⅠ基因片段，则标志着待检测样品为蜂巢小甲虫。

其中，所述特异性引物对为：

上游引物Aet-F：5’-GCGACCCTCAGGCATAAC-3’；

下游引物Aet-R：5’-ACCGAAGAATCAAAATAAGT-3’。

其中，所述PCR的反应体系如下：

GoTaq® DNA聚合酶 0.5 μL

dNTPs（200 μM） 2 μL

MgCl₂（25 mM） 1.5 μL

5×GoTaq Buffer 4μL

引物Aet-F（10 μM） 1 μL