[发明专利]一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

我国海域辽阔，海藻资源丰富，是全世界最大的海藻生产国。其中褐藻是开发最多的 种类，占藻类总产量的75％左右。褐藻酸是褐藻中所特有的生物活性多糖，作为天然生物 大分子已被广泛应用于食品、医药、化工等领域。但褐藻酸的分子量大，凝胶性强，在生 产加工、综合利用等方面受到很大的限制。而其水解后的褐藻寡糖，水溶性好，具有抗菌、 抗肿瘤、免疫调节、降血糖血脂和调节植物生长和防御等多种生物活性，目前已成为国际 上褐藻酸产品深入研发、高附加值利用的代表方向和研究热点。

褐藻寡糖的生产可以采用物理法、化学法和酶解法。但物理法操作复杂，降解条件难 以控制；化学法往往存在目标寡糖的产量低、回收率低和污染环境等问题。而酶解法具有 专一性强、条件温和、过程可控、得率高等优点，已逐渐成为褐藻寡糖生产最有潜力的生 产方式。作为褐藻寡糖生产的工具酶，褐藻酸裂解酶(alginatelyase)广泛存在于海洋软体 动物、棘皮动物和微生物等多种生物，其通过β-消除机制(β-eliminate)裂解褐藻酸单体 间的1-4糖苷键，在底物的非还原性末端生成不饱和糖醛酸，从而使得高聚物降解成一系 列长短不一的寡糖链。但目前褐藻酸裂解酶的研究基础薄弱，开发的褐藻酸裂解酶工业酶 制剂很少，褐藻酸裂解酶工业用酶的缺乏成为褐藻与褐藻酸高值化加工的瓶颈。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用。

一种海洋褐藻酸裂解酶基因gc，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

上述海洋褐藻酸裂解酶基因gc编码的海洋褐藻酸裂解酶GC，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌中转化有上述重组表达载体或表达上述海洋褐藻酸裂解酶 GC。

对上述褐藻酸裂解酶GC进行结晶检测，得到的褐藻酸裂解酶GC的三维结构如下：

褐藻酸裂解酶GC晶体结构分辨率空间群：P21，晶胞参数：α＝γ＝90°，β＝111.09°。褐藻酸裂解酶GC结构在一个晶体学不对称单位含有四个蛋白分子，每个蛋白分子分别含有一个氮端和一个碳端结构域，两个结构域之间通过一个长达54个氨基酸的linker相连。氮端结构域和碳端结构域分别形成右手平行β螺旋折叠结构(right-handedparallelβ-helixfold)。其中氮端结构域含有1个α螺旋和39个β折叠，碳端结构域含有1个α螺旋和29个β折叠。GC的催化腔主要位于氮端结构域，碳端结构域的一个柔性不规则卷曲也参与催化腔的形成。GC的催化中心特异性的结合有一个钙离子、一个磷酸根和碳酸根。(如图7)

上述海洋褐藻酸裂解酶GC和/或上述海洋褐藻酸裂解酶基因gc在褐藻酸裂解中的应 用。

褐藻酸裂解酶基因gc是从GlaciecolachathamensisS18K6^T的基因组DNA中克隆得到 的。对具备褐藻酸降解能力的该菌株全基因测序，得到可能编码褐藻酸裂解酶的基因gc， 褐藻酸裂解酶基因gc为一个含有2262个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码 754个氨基酸。根据信号肽在线预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，该基因包 含84个核苷酸编码的信号肽。切除信号肽区段，根据其序列设计特异性引物，利用PCR 技术从S18K6^T的基因组DNA中克隆了编码褐藻酸裂解酶的基因gc，构建了含褐藻酸裂解 酶基因gc的表达载体以及对含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞的核酸序列进行了测定。 序列分析表明，褐藻酸裂解酶GC属于多糖裂解酶第6家族。对纯化的褐藻酸裂解酶GC 进行性质测定。结果表明该酶对聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸均可降解，为双功能酶。最 适pH为7.5，,最适酶活温度为30℃，在40℃内活力较高，对NaCl不耐受。通过对野生 型褐藻酸裂解酶GC及硒代甲硫氨酸的褐藻酸裂解酶GC结晶得到其三维结构。

有益效果