[发明专利]检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒

权利要求书

1.检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，包括ELISA板、洗涤液、封被液、酶标二抗、 显色物、终止液和Di-TCTP蛋白抗原，其特征在于：

所述Di-TCTP蛋白抗原为Di-TCTP基因编码得到的蛋白，所述Di-TCTP基因序列如SEQ IDNo.1所示；

所述洗涤液为PBST，所述PBST为磷酸盐吐温缓冲液；

所述封被液为3wt％牛血清蛋白；

所述酶标二抗为HRP标记的羊抗狗IgG；

所述显色物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；

所述终止液为2.5NH₂S0₄。

2.根据权利要求1所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述 Di-TCTP蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：

a、从犬恶丝虫中提取得到RNA，并将其逆转录成cDNA；

b、以cDNA为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQIDNo.2所示；所述下游引物如SEQIDNo.3所示；

c、将PCR扩增得到的产物连接到表达载体，得重组表达质粒；

d、将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，得融合蛋白，过柱纯化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。

3.根据权利要求2所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：

所述PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL， 模板DNA1μL，ddH₂O9.5μL；

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性35sec，53.8℃退火35sec，72℃延伸35 sec，35个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求2所述的检测犬恶丝虫病的ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述表 达载体为pET-28a(+)。

5.检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，过夜，再使用PBST彻底清洗四次；

b、将已包被的ELISA板用100μL的3％牛血清蛋白封被1h，再使用PBST彻底清洗四 次；

c、加入待测血清100μL到孔内，室温处理1h，再加入HRP标记的羊抗狗IgG二抗反应 1h后，使用PBST彻底清洗四次；

d、加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺进行显色；显色反应由2.5NH₂S0₄终止，在波长为450nm 的光波下读取吸光度；

e、根据吸光度值判断检测结果。

6.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：a步骤所 述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被浓度为2.5μg/mL；c步骤所述的HRP标记的羊 抗狗IgG二抗稀释度为1:5000。

7.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：d步骤所 述的显色时间为5～30min，优选显色时间为10min。

8.根据权利要求5所述的检测血清中是否存在犬恶丝虫的方法，其特征在于：e步骤所 述的根据吸光度值判断检测结果，其判断方法为：若吸光度值大于或等于0.294，则血清中存 在犬恶丝虫，若吸光度值小于0.294，则血清中不存在犬恶丝虫。