[发明专利]蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为5’-AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3’，反向引物序列为5’-TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3’。

2.根据权利要求1的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：

（1）反转录预混液：，每个20μL反应体系包括5×反转录Buffer4μL；浓度为10μmol/L的反向引物1μL；5mmol/L的dNTP2μL；25mmol/L的MgCl₂2μL；40U/μLRNA酶抑制因子0.5μL，共9.5μL；

（2）PCR预混液：每个25μL反应体系包括2×PCRBuffer12.5μL；浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL；5mmol/L的dNTP1μL；25mmol/L的MgCl₂2μL，共16.5μL；

（3）反转录酶：200U/μL；

（4）TaqDNA聚合酶：5U/μL；

（5）阳性对照：将扩增的目的片段产物连接至克隆载体，转化大肠杆菌制备的感受态细胞获得阳性的克隆菌株；

（6）阴性对照：采用无以色列急性麻痹病毒感染的健康蜜蜂组织提取的总RNA作为阴性对照；

（7）RNase-freeddH₂O。

3.利用权利要求1或2所述的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL，RNase-freeddH₂O7μL，70℃孵育10min，短暂离心后冰浴5min，再加入反转录反应液9.5μL和浓度为200U/μL反转录酶0.5μL；在42℃孵育60min，95℃5min灭活反转录酶，冰浴5min，合成cDNA；

（2）PCR反应：在PCR管中加入PCR反应液16.5μL，步骤（1）合成的cDNA3μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，RNase-freeddH₂O5μL，总体积为25μL；PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，反应结束；

（3）PCR扩增产物电泳检测：取步骤（2）PCR扩增产物10μL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5V/cm～8V/cm，电泳30min～60min；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果，阳性目的条带大小为270bp。