[发明专利]一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种人工湿地堵塞缓解细菌的筛选方法，其步骤是：

A、细菌富集：在建成运行的人工湿地中收集堵塞物，取2g堵塞物，加入100ml无菌水，在 摇床上振荡3.5－4.5h，取上清液10ml接种到装有90ml富集培养基中，于28－32℃、120r/ min培养2－4d，再取培养液转接到富集培养基中，重复培养1－3次得培养液；

B、细菌初筛：（1）在初筛培养基中加上一张灭菌并均匀浸有液体石蜡的粗纤维滤纸，倒 平板时置于培养基内部表层，取富集培养液稀释，涂布于富集培养基上，于28－32℃培养5- 7d，挑选滤纸上产生斑点处的菌株纯化，得到有产表面活性剂性能降解纤维的细菌；（2）取 滤纸斑点上生长的菌株在LB培养基上划线纯培养；

C、细菌复筛：取纯培养后的菌株接种于血琼脂培养基上，于27.3－29.3℃培养2－3d， 挑选产生透明溶血圈的菌落，获得细菌产表面活性剂；

D、细菌优选：再按步骤（A）进行细菌富集发酵得到纯培养液，取培养皿加入80ml蒸馏水 后，加入100μL正己烷使之在水表面形成油膜，取10μL培养液加到油膜中央，油膜会从中央 扩散形成排油圈，排油圈直径与生物表面活性剂的浓度呈正比，测得排油圈大的纯培养菌 株；

E、筛选菌产物鉴定：取筛选出的培养液30ml，1200r/min离心18-22min去除菌体，共离 心2-4次；上清液用浓盐酸调节至pH=1.8－2.2，出现絮状沉淀，4℃静置过夜，1200r/min离 心14－16min收集沉淀，用pH=1.8－2.2的酸水洗1－2次，分离沉淀，使用1M氢氧化钠溶液溶 解至中性，用二氯甲烷抽提，取有机相，挥发后冷冻干燥得到生物表面活性剂，该生物表面 活性剂为糖脂或脂肽，将样品溶于二氯甲烷配成溶液进行薄层层析，展开剂为正丁醇/乙 酸/水（体积比为16/4/8），显色剂为：苯酚-硫酸试剂：3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇 中，糖脂显棕色斑点，茚三酮显色剂：0.5%（质量体积比）茚三酮无水丙酮溶液，脂肽显红 色；

所述的富集培养基组成为：六水合硝酸氨1g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，七水合硫 酸镁0.2g，二水合氯化钙0.02g，七水合硫酸亚铁2.5×10^-5g，5ml液体石蜡，1000mlH₂O，pH= 7.0，其中液体石蜡刺激微生物产生表面活性剂；

所述的初筛培养基组成为：富集培养基去掉液体石蜡，加上2%体积比琼脂倒成的固体 平板；

所述的LB培养基组成为：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl10g，pH=7.0；

所述的血琼脂培养基组成为：牛肉膏蛋白胨培养基，pH=7.4－7.6，冷却至48－52℃按 10%加入兔血，摇匀倒平板。

2.权利要求1所述的一种人工湿地堵塞缓解菌在缓解人工湿地堵塞中的应用，其步骤 是：

A、将筛选出的最优菌种进行富集培养，取上清液测定培养液中表面活性剂的浓度；

B、将培养液投配进湿地进水，使表面活性剂的用量为0.09－0.15g/L；

C、进水进入湿地停留8－20h，溶脱湿地堵塞，鼠李糖脂具有亲水基和疏水基，其疏水基 端与胞外聚合物有机基团结合，亲水端与人工湿地中堵塞物孔隙水结合，改变了胞外聚合 物在固相和液相中的分配，使胞外聚合物结构破坏，分散并增溶由胞外聚合物连接的大颗 粒堵塞物；

D、放空湿地3－5h，过量积聚的胞外聚合物被溶脱，出水携带被增溶和分散的堵塞物， 恢复湿地孔隙率和水力传导能力；过量的胞外聚合物蓄积使得湿地污染底物与酶接触时透 过蛋白质层、多糖层、有机化合物层阻力增大，鼠李糖脂的加入破坏了胞外聚合物结构，能 释放被束缚的酶活，增强微生物、酶及底物的接触，鼠李糖脂溶脱人工湿地堵塞，提高湿地 微生物活性和提高湿地酶系活性；

E、根据湿地具体情况，溶脱开始出现堵塞趋势或已经堵塞的人工湿地数次，至湿地堵 塞状况改善。