[发明专利]一种结构光照明显微镜的成像方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及光学显微镜技术领域，尤其涉及一种结构光照明显微镜的成像方法及装置。

背景技术

现代的生命科学研究中，显微镜是必不可少的研究工具。然而由于光的衍射，传统的光学显微镜存在分辨率的极限，这个分辨率的极限可以由瑞利判据(Rayleigh criterion)给出：R＝0.61λ/NA，其中λ是光的波长，NA是显微物镜的数值孔径。近年来，出现了各种用于提高光学显微镜分辨率的方法，结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscope，SIM)就是其中之一。与其他的方法相比，如：随机光学重构显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM)，光激活定位显微镜(Photo Activated Localization Microscopy，PALM)，受激发射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)，SIM的图像重构过程中所需的原始图像数量最少，合成每帧超分辨图像所需采集数据的时间最短，此外SIM的原始图像采集是宽场成像，成像速度受视场大小影响不大。故SIM是各种超分辨成像方法中最适合观察活细胞或宽视场中快速成像的方法。

现有的结构光照明显微镜的基本结构如图1所示，采用相干或非相干的准直宽光束作为光源1，入射光经过光线调制器件2，被调制后经过由透镜3、二向色分束器8及物镜9组成的成像系统，然后调制出的图案投影在照明样品10上，并在照明样品10所在的平面上形成周期性的光强分布。在使用相干光源的情况下，也可以选择性的加入由透镜4、空间滤波器5及透镜6组成的空间滤波系统，以滤除零级衍射分量，滤波后的光继续通过由二向色分束器8及物镜9组成的成像系统，在照明样品10所在的平面处干涉生成结构光照明图案。被照明的样品的光通过由物镜9、镜筒透镜11组成的显微系统后被探测器13采集。

现有技术中，通过结构光照明显微镜随时间推移生成SIM序列(time-lapse SIM)，其成像过程如下：

在一组结构光照明图案下，每张结构光照明图案都拍摄一张原始图像，对这一组原始图像进行图像重构得到一张SIM超分辨图像。下一张SIM超分辨图像使用下一组结构光照明下的原始图像重构得到。重复上述过程，获得多个SIM超分辨图像，构成SIM超分辨图像的时间序列。

最早的SIM中，用于调制结构光分布的器件为光栅。不同结构光照明图案的调制与切换是通过平移或旋转光栅实现的。由于系统中存在机械运动的部分，其成像速度相对较慢。之后的SIM普遍采用空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)以及数字微镜器件(Digital Micro-mirror Device，DMD)这两种光电器件调制结构光照明图案。由于SLM和DMD响应速度快，再加上高灵敏度的探测器如电子倍增CCD(EMCCD)、科学级CMOS(sCMOS)能够大幅的缩短曝光时间，这些都为SIM的高速成像提供了有利条件。

若要再进一步提升SIM的成像速度，需要通过增大照明光强缩短曝光时间，从而提高成像的时间分辨率。然而在荧光成像中，照明光强的增强会加速荧光分子的光漂白效应，缩短总体的观察时间，这在活细胞成像中是很不利的，需要折中考虑。故在现有光电器件响应速度和探测器灵敏度的条件下，SIM的时间分辨率很难有大幅的提升。

发明内容

本发明提供一种结构光照明显微镜的成像方法及装置，以解决现有技术中结构光照明显微镜成像的时间分辨率难以进一步提升的技术问题。

为此目的，第一方面，本发明提供一种结构光照明显微镜的成像方法，包括：

按照预设顺序循环切换预设的N张结构光照明图案，N为预设常数；

获取待成像样品在每张结构光照明图案下的原始图像，得到所述待成像样品的原始图像序列；

将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像进行图像重构，得到所述待成像样品的超分辨图像序列。

可选地，所述将所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像进行图像重构，得到所述待成像样品的超分辨图像序列，具体包括：

计算所述原始图像序列中每N张原始图像中混叠的各空间频谱分量，得到多个空间频谱分量组，所述N张原始图像由所述原始图像序列中的每张原始图像与其之后的N-1张原始图像组成；