[发明专利]一种判定萧山鸡中B21血型的方法以及鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种判 定萧山鸡中B21血型的方法以及鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒。

背景技术

由于B21血型类别与鸡的抗病力、生产性能具有密切联系，在遗传育种工 作中具有较好的参考价值并且已应用于生产实践中。目前，大多数对于家禽血 型的确定均采用免疫学方法。由于鸡血型系统多而复杂、血清中自然抗体弱， 不易被检出，且特异性的抗血清制备技术比较复杂使得一些地方鸡品种的血型 难以确定。然而，分子标记技术具有特异性高、操作相对简单等优势，能解决 传统技术上的存在问题，可以实现对血型的快速、准确判定。应用分子标记进 行血型判定将为鸡血型的判定打开一个新局面。由于微卫星DNA具有高度的个 体专一性和多态性，使得微卫星DNA标记技术能有效反映群体内和群体间的遗 传变异，是分析畜禽遗传多样性最理想的分子标记。国外有相关研究表明鸡MHC 基因的多态性与血型有一定的关联，其中B血型由MHC基因的Ⅰ、Ⅳ区共同决 定，MHC基因具有丰富的多态性，而LEI0258是MHC基因上的一个微卫星位点， 此微卫星位点在不同鸡种及同一鸡种的不同个体之间表现出丰富的多态性，利 用这一分子标记技术可以更方便快捷的对血型进行判定，而这一技术也还未得 到充分有效的利用。因此我们可以利用LEI0258位点标记对中国地方鸡种的B 类血型进行分型；另外，国内鸡的育种多为现场育种，分子标记技术无法进入 现场，目前，急需一种现场简单的血型判定方法，来提高育种现场中血型分型 的准确性和可靠性，从而加速鸡抗病育种进展。

发明内容

本发明的目的是运用简单分子标记技术和红血球凝聚反应判定萧山鸡B21 血型并可以运用试剂盒进行快速鉴定。

本发明的技术方案是：利用引物设计及微卫星测序技术分析萧山鸡MHC基 因的MHC-Ⅳ座位遗传多态性，根据等位基因大小对萧山鸡进行血型分型。首先 根据GeneBank中MHC基因(AL023516)序列，经Primer3设计特异性较好的PCR 引物，进行扩增条件的优化，并以此为基础设计试剂盒，PCR产物送生物公司进 行分型分析。根据微卫星位点LEI0258的重复序列结构数目的不同对萧山鸡进 行血型初步判定，然后通过同种免疫、纯化等步骤制备B21血型特异性抗体血 清，最后根据红血球凝集反应结果迅速判别出B21血型个体。

一种判定萧山鸡中B21血型的方法，包括以下步骤：以萧山鸡个体DNA作 为模板，以SEQIDNO.1和2的序列为引物进行PCR扩增；对扩增产物测序并 根据微卫星LEI0258重复序列结构单元数目对不同萧山鸡个体进行判型，具有1 个R13和17个R12重复结构的序列为B21血型序列；确定B21血型个体；所述 R13的序列如SEQIDNO.4所示，所述R12的序列如SEQIDNO.3所示。

为了进一步快速检测，在已确定B21血型个体的情况下，本发明还包括以 下步骤：采集已确定为B21血型个体的血液，通过同种免疫、纯化步骤制备抗 B21血清；采用得到的抗B21血清，根据平板红血球凝集反应方法检测萧山鸡 B21血型。

所述制备抗B21血清的方法是常规的，例如：采集B21血型个体血液2ml, 抗凝处理后1200RPM离心10分钟，去上清，用PBS洗红血球3遍，制成免疫用 红血球，采集2ml免疫红血球注射非B21血型萧山鸡第一受体翅静脉，7天后再 以此方法注射1次，13天后采集受体1个体的抗凝血液6ml,1200RPM离心20 分钟，获取上清，初步得到抗B21血清；在群体中采集非B21血型且与第一受 体不同血型的个体血液，与初步得到抗B21血清1:1进行等体积混合，30度水 浴10分钟后，1200RPM离心10分钟后，采集上清，获得纯化的抗B21血清。

所述平板红血球凝集反应方法是常规的，例如：采集被检个体新鲜血液， 1200RPM离心10分钟后，去上清，用PBS制成2％的红血球悬液，然后与等体积 抗B21血清混合，阴性对照加入PBS，室温下静止30分钟后观察红血球凝集状 态，红血球凝集，下沉程网状，则判定为阳性，即B21血型；如无凝集，红细 胞呈点状分布，则为阴性。

本发明还公开了一种鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒，该试剂盒包括：