[发明专利]一种高粱幼穗匀浆液体再生培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高粱幼穗匀浆液体再生培养方法，属于高粱幼穗匀浆液体培养技术领域。

背景技术

植物组培再生是一项重要的基础生物技术，它在植物快繁和转基因研究应用等方面发挥重要作用。

高粱是全球第5大农作物，具有食用、饲用和酿造用等多种用途。由于高粱生物技术育种滞后于玉米等作物，所以高粱生产水平和育种水平都相对落后。造成高粱生物技术育种落后的原因很多，但高粱组培再分化难从而限制了高粱组培转基因研究应用是其重要原因之一。显然研究发明不同再生系统是非常有意义的。

目前，高粱再生培养系统是固体培养基模式，基本流程是：选取某一种外植体，消毒后接种于固体培养基上，4周左右诱导出愈伤组织，然后转接到新固体培养基上进行3-5周的继代培养，最后转入固体培养基进行再生苗分化培养。据了解，目前高粱组培再生普遍采用这种单一化的固体培养基再生培养模式。

发明内容

为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种高粱组培苗再生培养周期短，效率高的高粱液体培养再生方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种高粱幼穗匀浆液体再生培养方法，按照以下步骤进行操作，

a、幼穗取材，在大田高粱幼穗分化初期的植株，剥离取出幼穗；

b、匀浆接种，在无菌超净台上将幼穗放入玻璃匀浆器，加入2-3mL起始培养液进行匀浆，然后接入到装有液体起始培养基的250ML三角瓶中，起始培养液为MS+2,4-D3mg/L-+KT0.5mg/L+蔗糖3.0%，PH6.0；

c、匀浆物培养，把接好种的三角瓶置于摇床上进行培养，摇床转速为120r/min，温度为22-25度，待新芽萌动后再转接入固体分化培养基中，固体分化培养基为MS+KT0.5mg/L+琼脂8g/L+蔗糖3.0%，PH6.0，去掉琼脂即得到液体分化培养基。

优选的，所述步骤a中，在田间选取幼穗长约为1-3cm长的高粱植株，分三次进行剥离；第一次剥离，在一般条件下进行，不能露出幼穗，仍保留多层叶片；第二次剥离，在超净台上进行，先用70%酒精纱布擦洗，再剥离部分叶片，但不能全剥，仍保留数片叶；第三次剥离，用70%的酒精浸泡60s，最后用手术刀片将幼穗剥出。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明采用全新的再生模式，为植物遗传转化提供了一种新的实验方法,并且高粱组培苗再生培养周期明显缩短，效率高。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中在进行幼穗取材时，要避免雨后，要选在数天晴天后采样，否则容易污染。同时在进行匀浆物培养时，因品种的原因或者匀浆力度差异的原因，有些品种生长慢，这种情况下就需要继代培养，一般10天左右继代一次，当培养形成直径3mm以上的颗粒时，就可转入固体分化培养基中进行分化培养；对于那些匀浆力度小，匀浆物粗大的材料，培养物生长快，10-15天就可生成直径3mm以上的粒状培养物，中间无需转接继代培养，可直接将培养物接入液体分化培养基，待新芽萌动后再转接入固体分化培养基中。

实例一

一种高粱幼穗匀浆液体再生培养方法，按照以下步骤进行操作，以忻七为例，忻七是高粱的一个恢复系，该品种于2010年4月28日进行田间播种，7月上旬开始幼穗分化，7月12日田间取材，即选取幼穗预估长度为2cm左右的植株，剪取上半部分，并稍作整理，去掉大叶片，不能让幼穗外露。材料取回后暂存于冰箱冷藏，次日接种前，先在一般条件下去掉部分苞叶和幼茎，保留10cm左右长，仍保留多层叶片不能露出幼穗。然后在超净台上，先用70%酒精纱布擦洗，再剥离部分叶片，但不能全剥，仍保留数片叶。最后，用70%的酒精浸泡60s(时间长短以酒精不渗透到幼穗为宜)，用手术刀片将幼穗剥出。

把剥离出的幼穗放入玻璃匀浆器中，同时加入3ml培养液进行匀浆，然后把匀浆物接入到含有25ml液体起始培养基（MS+2,4-D3mg/L-+KT0.5mg/L+蔗糖3.0%，PH6.0）的250ml三角瓶中。放置于摇床上震荡培养。