[发明专利]一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法

权利要求书

1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天；

2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时，液体种子培养基中含有KH₂PO₄ 8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，pH5.0；

3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6N NaOH调一次pH至7.5-8.0；所述发酵培养基中含KH₂PO₄ 10g/l，蔗糖20g/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nC₁₂200ml/l，自来水配置，pH7.2，在110℃下灭菌30分钟；

发酵结束后，用6N的HCl调节pH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC₁₂白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC₁₂含量为89.8g/l，纯度99.43％，其中一元酸含量0.009％；

其中，所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candida tropicalis)；

所述固体斜面为10巴林糖度的麦芽汁液体培养基。

2.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，其特征在于包 括以下步骤：

1)、取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天；

2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时，液体种子培养基中含有KH₂PO₄ 8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆3g/l，蔗糖30g/l，尿素3g/l，自来水配置，pH5.0；

3)把3000mL培养两天，OD为0.81，pH 3.8，健壮，无杂菌种液接入装有700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子；

4)把3)中培养的健壮，无杂菌的700L种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子；

5)把4)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nC₁₂ 4m³，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生28.5g/L DC₁₂，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到120g/L，70小时后每天补加一定量nC₁₂，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)；发酵139小时，产酸量达205.8g/L，发酵到163小时结束，产酸量达225g/L；

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC₁₂，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H₂SO₄至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC₁₂产品；nC₁₂转化率为92.8％，后处理总收率达到90.5％，DC₁₂纯度达到99.35％，其中一元酸的含量0.008％；

其中，所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为保藏号CCTCC NO.M2014545的热带假丝酵母(Candida tropicalis)；

所述固体斜面为10巴林糖度的麦芽汁液体培养基；

所述发酵培养基中含KH₂PO₄ 10g/l，蔗糖20 g/l，酵母膏3g/l，玉米浆3.5g/l，尿素1.5g/l，以及nC12 200ml/l，自来水配置，pH7.2，在110℃下灭菌30分钟。