[发明专利]一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离和培养方法

权利要求书

1.一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于，包括：

1）将长爪沙鼠的肝脏，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson 鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物；

所述的长爪沙鼠为生前体重60g；

所述的长爪沙鼠的肝脏的获得包括：对刚死亡的长爪沙鼠进行开腹，游离腹主动脉，向游离腹主动脉中灌注预灌注液，取下肝脏，即得到长爪沙鼠的肝脏；

所述的预灌注液为4℃、含肝素25 U/ml的Hank’s液；

所述的联合酶液，由以下体积百分数的组分组成：0.02%~0.08%的链酶蛋白酶和0.05%~0.2%的胶原酶以及余量的Hank’s液；

所述的灌注消化的条件为：37℃灌注消化10min；

所述的混合酶液，由以下体积百分数的组分组成：0.02%~0.08%的链酶蛋白酶、0.05%~0.2%的胶原酶、0.0005%~0.003%的DNaseI 以及余量的Hank’s液；

所述的搅拌消化的条件为：37℃搅拌消化10～15min；

2）向搅拌消化后的产物中加入第一Hank’s液，过滤，得肝组织；然后向肝组织中加第二Hank’s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’s液重悬沉淀，再向其加入20%Nycodenz液混匀，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞；

所述第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均为4℃Hank’s液。

2.根据权利要求1所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于， 步骤2）中，所述的过滤采用80目~120目的钢丝筛。

3.根据权利要求1所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于， 步骤2）中，所述的初步离心的条件为：300g~400g、5min~20min；

步骤2）中，所述的再次离心的条件为：2℃~6℃、1200g~1600g、13min~23min。

4.一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：权利要求1~3任一项所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法以及培养；

所述的培养包括：取分离得到的肝星状细胞，以1×10⁵～1×10⁶个/ml接种密度进行原代培养；当细胞融合度为80%~90%时，进行传代培养。

5.根据权利要求4所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法，其特征在于，所述的原代培养的培养基由体积百分数5%~15%的胎牛血清和85%~95%的DMEM培养液组成。

6.根据权利要求4所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法，其特征在于，所述原代培养和传代培养的条件为：在35℃~39℃、由体积百分数2%~8%CO₂和92%~98%空气组成的气氛中培养。