[发明专利]一种1;3-1;4-β-葡聚糖酶突变体

说明书

本发明公开了一种1,3‑1,4‑β‑葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将特基拉芽孢杆菌(Bacillus terquilensis)CGX 5‑1来源的1,3‑1,4‑β‑葡聚糖酶的第40位的丝氨酸和43位的丝氨酸、46位的谷氨酸和205位的组氨酸通过迭代饱和突变的方法分别突变为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸和脯氨酸，最终获得四株单突变体和三株复合突变体。七株突变酶均表现出了更好的热稳定性，尤其是S40E/S43E/E46P/H205P突变酶具有极佳的热稳定性。这些突变酶和野生酶相比更有利于其在工业上的应用。

技术领域

本发明涉及一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

β-葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1,3或β-1,4糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量β-葡聚糖，在麦汁中β-葡聚糖未能及时降解会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。在纯生啤酒的生产过程时，过多β-葡聚糖的存在会造成滤膜的膜孔堵塞，导致过滤能力下降。在饲料行业中，大麦和小麦等饲料中含有大量的β-葡聚糖。无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能将β-葡聚糖直接消化吸收，其必须经过酶降解后才能被利用，且β-葡聚糖会阻止饲料有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分的转化率，是一种抗营养因子。与此同时，β-葡聚糖为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养，造成大量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。

来源于特基拉芽孢杆菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，简称β-葡聚糖酶。1,3-1,4-β-葡聚糖酶可以在3-O-吡喃葡萄糖位点专一性切割β-葡聚糖，最终产物为三糖和四糖。然而，现有的β-葡聚糖酶的热稳定性并不满足目前的工业应用。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从48℃提高至78℃，而饲料行业中烘焙的温度也在65℃以上。而目前筛选得到的大部分野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的最适温度主要集中在45℃和55℃，而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够提高野生型1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β-葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。

为了提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经对其已经进行了一系列研究。对β-葡聚糖酶的杂交结果显示，将浸麻芽孢杆菌(B.macerans)来源的前16个氨基酸替换为淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)来源的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16-M)和两者之间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M)-△13在高温下有很好的稳定性。GLN1、THR2、SER5和PHE7位点的突变大幅度的降低了β-葡聚糖酶的热稳定性。这说明β-葡聚糖酶的N端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而钙离子对于在高温下维持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多个赖氨酸进行定点突变研究发现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的三突变酶(BglTM)的热稳定性和催化活力都有了一定程度的提升。在β-葡聚糖酶三维结构中添加N31C-T187C和P102C-N125C两个二硫键也提高了β-葡聚糖酶的热稳定性。但是目前得到的改造酶BglTM的热稳定性依旧不能适应工业应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热稳定性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体。