[发明专利]一种快速诊断结核病潜伏感染的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及采用分子生物学快速检测的技术领域，尤其涉及一种qRT-PCR技术快 速诊断结核病潜伏感染的引物及试剂盒。

背景技术

近年来结核病疫情呈加重蔓延之势，其发病和死亡人数均居甲、乙两类传染病之 首，给个人、家庭、社会造成了沉重的经济负担和精神压力。世界上约1/3的人感染 了结核分枝杆菌，其中约90％的人呈结核潜伏感染状态(latentTBinfection,LTBI)。 大多数活动性结核都是因为潜伏感染者体内结核分枝杆菌重新激活所致，所以及早诊 断、早治疗潜伏感染者是降低结核病发病率，控制结核分枝杆菌传播的重要途径之一。

结核潜伏感染者因其没有临床症状和体征，诊断比较困难。目前用于诊断结核潜 伏感染的方法，是干扰素γ释放实验(interferongammareleaseassays,IGRAs)， 但IGRAs无法区分活动性结核患者和结核潜伏感染者。结核潜伏感染者常被看成一种 感染但是并未发病的人群，但不同的结核潜伏感染者对结核分歧杆菌感染的免疫应答 能力并不完全相同，活动性结核患者也有类似的特征。为了能够快速、准确筛查结核 潜伏感染者，本发明采用qRT-PCR技术设计独特的、对结核分歧杆菌具有良好敏感性、 特异性的引物和试剂盒，对实现微量外周血快速诊断结核潜伏感染提供有效的辅助作 用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于结核病潜伏感染检测的引物及试剂盒。

本发明的技术方案，qRT-PCR技术快速诊断结核病潜伏感染的引物，包括如下引 物中的至少一组引物：

第一组：<210>1，<210>2。

第二组：<210>3，<210>4。

第三组：<210>5，<210>6。

qRT-PCR技术快速诊断结核病潜伏感染的试剂盒，其组成成分包括：SYBR酶、cDNA 和下列引物引物中的至少一组：

第一组：<210>1，<210>2。

第二组：<210>3，<210>4。

第三组：<210>5，<210>6。

结核潜伏感染者的静脉血经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后TNF-α、IFN-γ、 IL-2的mRNA表达水平2.5-4.1、8.1-13.2、184.2-220.6。

与现有技术相比，本发明引物和试剂盒根据结核分歧杆菌的特异基因序列而定， 寻找具有易于预测的、检测的、发展价值的TNF-α、IFN-γ、IL-2因子，其在结核 病患者、结核潜伏感染者和健康人中的mRNA表达水平，特异性、敏感性高，而且用 血量少、用时短等特点，利用荧光定量PCR方法、使用本发明引物和试剂盒进行检测 时，只需400μl外周静脉血，有利于用于筛查老年人及儿童结核分枝杆菌潜伏感染， 整个过程耗时小于8小时。本发明对于结核病潜伏感染检测及临床用药都有较高的参 考价值，可以广泛推广，为结核病防控工作提供技术支持。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。

以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明 的保护范围。

实施例1

检测方法：

(1)采集受试者(潜伏感染者)外周静脉血：肝素钠抗凝处理，所有血样，一 经采集，立即送检。取400μl分为两份，每份200μl。一份加入合成的特异性抗原 (ESAT-6、CFP-10、TB7.7)，使其终浓度均达到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺 激物作为对照组，是基础分泌水平值，两份血样斡旋震荡后，放入37℃温箱孵育4 小时。

(2)血总RNA的提取：血样孵育4小时后，用RNeasyMiniKit(Qiagen)试 剂盒按说明书逐步提取总RNA。为减少RNA降解，离心机温度设定为4℃，所有操作 在冰袋上进行，并根据核酸蛋白检测仪检测D260/280紫外吸收率，确定RNA纯度， 琼脂糖凝胶电泳观察其完整性。