[发明专利]一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞和再生医学领域，具体涉及一种脂肪干细胞-水凝胶三维 培养体系的制备方法及应用。

背景技术

干细胞(Stemcells，SCs)是能够分化成组成肌体组织的多种细胞类型的细胞。 干细胞处于未分化状态，可在一定的刺激条件(例如环境刺激)下分化成具体的细胞 类型。干细胞总体上分为两类，即胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞分离自胚胎， 具有分化成所有细胞类型的潜能，因此胚胎干细胞具有全能性(美国专利申请号 20130023048A1)。成体干细胞是指存在于已经分化的组织中的未分化细胞，这种细 胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞，因此具有多能性。成体干 细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多 处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。

由于干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，因此可以作为一种理想的生物学平 台，用于多方面的科学研究与临床应用，如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的 分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载 体的建立、细胞治疗及再生医学等。在目前研究的各种干细胞中，间充质干细胞 (mesenchymalstemcells，MSCs)由于具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、 免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定 的诱导条件下，可分化为例如脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、 内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想 的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。

脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得 到的一种具有多向分化潜能的干细胞，其主要组成为脂肪间充质干细胞。研究发现 ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可 获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储 备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一(中国专利申请号 CN104611290A)。现有的研究表明，脂肪干细胞在特定的诱导条件下，具有分化为 同胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，外胚层来源的神经细胞、表皮细胞， 内胚层来源的肝细胞、内皮细胞、分泌胰岛素的β样细胞等不同胚层来源细胞的潜能。 脂肪干细胞在不同诱导条件下的分化方向不同，因此构建脂肪干细胞的定向分化培养 体系对于脂肪干细胞用于组织工程和再生医学具有非常重要的意义。

当前的主流干细胞培养体系主要采用二维细胞培养技术，细胞在平板表面或者培 养瓶中以单层形式贴壁生长(参见图1)。二维细胞培养技术不能模拟细胞在人体内 生长的三维环境，细胞间、细胞与胞外基质间的联系极少，细胞在生长过程中易失 去其原有的形态特征及生长分化能力，因此对干细胞的培养十分不利。而且，由于细 胞在平板表面贴壁生长，干细胞二维培养后往往需要经消化后再注射，对细胞活力的 损失较大，并且细胞消化后表面抗原消失，易受机体免疫系统的攻击，不利于干细胞 体内存活，再生组织的形成效果较差。此外，干细胞二维培养的生产效率低和与之相 伴随的成本高也是一个困扰干细胞组织工程的棘手问题。

因此近年来在利用干细胞的组织工程和再生医学领域，人们开始尝试使用三维的 材料和体系来培养和定向分化干细胞。三维细胞培养是指将具有三维结构的载体与各 种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、 生长,构成三维的细胞-载体复合物。

中国专利申请CN201110191645.4公开了一种人体iPS细胞未分化扩散的水凝胶 培养支架的制备方法，其使用了合成高分子水凝胶为细胞培养支架，合成高分子凝胶 具有化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌并且廉价 的优势。其中用于制备高分子的单体包括甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸甲酯、N- 乙烯基吡咯烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N,N’二甲基丙烯酰胺。

中国专利申请201310041348.0公开了一种模拟体内微环境的干细胞培养体系， 其利用琼脂糖构建了三维支架材料，模拟体内微环境动态培养干细胞，并测试了经培 养的脂肪干细胞维持自我更新、增值、归巢及向内皮细胞定向分化的能力。